利用免疫组化方法初步鉴定雌性三疣梭子蟹视神经节GnRH受体

为了研究促性腺激素释放激素(GnRH)受体在甲壳动物视神经节中的存在及分布情况,采用MaxVisionTM免疫组织化学方法,以兔抗人GnRH受体的多克隆抗体,对不同发育期雌性三疣梭子蟹的视神经节进行了免疫组织化学定位。结果显示,GnRH受体的免疫阳性物质在视神经节的多个部位,视神经层、视外髓、视内髓、视端髓及X器中都有较为广泛的存在,在视外髓、视内髓与X器处的神经分泌细胞中尤为明显。不同发育期的雌性三疣梭子蟹视神经节GnRH受体的免疫阳性分布位置相似,免疫阳性强度存在一定的差异。三疣梭子蟹视神经节存在的GnRH受体免疫阳性物质,为GnRH参与视神经节调节作用提供了形态学依据。     

锯缘青蟹促雄腺发育的组织学研究

采用组织切片技术，以OlympusBH-2型显微镜对锯缘青蟹(Scylla serrata)促雄腺的发育进行观察。结果显示，促雄腺附着于射精管近末端，发育过程可分为4期：Ⅰ期促雄腺短小，腺细胞数量少；Ⅱ期促雄腺呈明显的索状；Ⅲ期促雄腺体积达到最大，一些部位膨大增生；Ⅳ期促雄腺不再生长，腺体急剧退化。腺细胞具有2种类型：A型细胞，核圆、异染色质少、胞质染色浅；B型细胞，核扁平、异染色质多，细胞染色深、界限不清晰，有时细胞质消失。促雄腺发育过程中，A、B型细胞数量、比例发生变化。B型细胞为A型细胞完成分泌后的存在形式，B型细胞比例反映了促雄腺分泌活动的状况。锯缘青蟹促雄腺发育和精巢成熟具有一定的相关性。     

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴 侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。 同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78 基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量 较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。     

近缘新对虾cyclin B基因的克隆与原核表达

采用RACE技术,克隆了近缘新对虾cyclinB基因,该序列全长1 667 bp,编码区1 209bp共编码402个氨基酸,所推导的氨基酸序列N端不存在信号肽.BLAST比对后发现,其氨基酸序列与刀额新对虾的同源性达90％.经RT-PCR检测,cyclin B基因在近缘新对虾的卵巢和肌肉中表达水平最高,胸神经节和心脏次之,鳃、眼柄神经节、肝胰腺几乎没有表达.推测主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.原核表达结果显示,pET32a表达载体在0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导4h条件下可得到纯度较高的分子量约67 ku的蛋白.     

拟穴青蟹卵泡抑素相关蛋白基因的克隆和表达分析

卵泡抑素相关蛋白(follistatin related protein,FRP)是一种细胞外基质糖蛋白,该蛋白参与细胞增殖、迁移、组织重塑、胚胎发育、细胞间相互作用等多种生理过程。迄今甲壳动物FRP的研究尚未见诸报道。实验采用RACE技术首次克隆了拟穴青蟹FRP基因部分cDNA序列。该序列长度1 948 bp,FRP肽段含有484个氨基酸残基,包括KAZAL-FS结构域、EFh结构域和两个Ig结构域。系统进化树显示拟穴青蟹FRP基因的分子进化地位与其生物学分类地位一致。半定量PCR及荧光定量PCR结果表明,FRP基因在拟穴青蟹的胸神经团、脑和卵巢中表达。FRP基因在卵巢发育各期的表达量各不相同,卵巢未发育期最高,据此我们推测FRP具有抑制卵巢发育的作用。     

拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。     

锯缘青蟹脑内5-HT和NPY的免疫细胞化学定位

为探讨5-羟色胺和神经肽Y在锯缘青蟹脑内的存在与否和分布状况，应用免疫细胞化学技术，在光学显微镜下观察5-羟色胺和神经肽Y阳性细胞和神经髓质的形态和分布。结果表明：在锯缘青蟹脑中共12个胞体群和11个神经髓质中，前脑和中脑中有4个细胞群和6个神经髓质检出5-HT免疫阳性反应；中脑和后脑中有7个细胞群和3个神经髓质具有NPY免疫阳性反应。5-羟色胺和神经肽Y在锯缘青蟹脑内的特异性分布，为其参与神经牛理活动提供了形态学证据。     

拟穴青蟹ANT2基因在不同温度和盐度条件下的应激表达

采用qRT-PCR技术, 对不同温度(10℃, 15℃, 20℃, 25℃)以及低温(10℃, 15℃)和盐度(10, 35)联合作用下拟穴青蟹(Scylla paramamosain)(甲壳长3.7~5.8 cm, 体质量80~100 g) ANT2基因的表达进行了检测。结果表明: 在4个温度下肝胰腺、肌肉、鳃中ANT2基因表达量依次为低、中、高, 存在组织表达特异性。随着温度降低, ANT2基因总体上趋低表达, 但在15℃时ANT2基因在肌肉(1~12 h)和鳃中均显著高于20℃(P<0.05)。该结果提示, ANT2基因与能量代谢相关, 且在一定低温下被诱导表达, 可能参与低温胁迫的应答。相同低温下, 3种组织中ANT2基因在盐度10的表达量通常高于盐度35的(P<0.05), 说明低温下低盐环境有利于提高青蟹体内代谢, 增强耐寒能力。     

锯缘青蟹促雄腺进行全浆分泌的证据

采用透射电镜技术，对锯缘青蟹(Scylla serrata)促雄腺细胞的分泌活动进行了观察。结果表明，腺细胞具有2种类型：A型细胞核内常染色质丰富，具有大量的扁平嵴的线粒体、粗面内质网与核糖体，A型细胞进行分泌时，细胞质大量排出，属于全浆分泌方式；B型细胞异染色质绕核内膜分布，仅见极少量的细胞器或细胞质完全消失。B型细胞为A型细胞完成分泌后的存在形式。本研究为甲壳动物促雄腺的全浆分泌活动提供了直接的证据。     

拟穴青蟹3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与表达

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase,GAPDH)是维持生命最基本活动的关键酶之一.采用RT-PCR、RACE等技术,获得了拟穴青蟹gapdh基因全长cDNA序列.该序列全长1 440 bp,开放阅读框(ORF)为1 008 bp,编码335个氨基酸残基.同源分析显示,该基因编码的蛋白与其他一些物种具有很高相似性,推测gapdh基因具有很高的保守性.经荧光定量PCR检测,gapdh基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且在胸神经团、眼柄神经节、卵巢、表皮中表达量较高.在拟穴青蟹卵巢发育过程中,gapdh基因在卵巢发育早期(Ⅱ期)表达量最高,在卵巢发育成熟期(Ⅴ期)表达量最低,由此推测GAPDH主要参与了卵巢的细胞分裂增殖过程.