三疣梭子蟹多克隆抗体与4种经济蟹类血细胞交叉反应的研究

采用激光共聚焦扫描显微镜技术、免疫印迹技术和流式细胞术3种方法对鼠抗三疣梭子蟹血细胞多克隆抗体与黄道蟹、日本蟳、中华绒螯蟹、勘察加帝王蟹血细胞的免疫交叉反应进行分析。激光共聚焦扫描显微镜结果表明,该抗体与黄道蟹、日本蟳、勘察加帝王蟹、中华绒螯蟹血细胞均发生了免疫交叉反应,且发生反应的抗原决定簇均位于细胞膜上;流式细胞术测定该抗体与黄道蟹颗粒血细胞和透明血细胞交叉反应阳性率最高,分别为99.45%、98%,与中华绒螯蟹颗粒血细胞和透明血细胞交叉反应阳性率最低,阳性率分别为81.34%、78.56%;免疫印迹结果显示该抗体与日本蟳血细胞结合的蛋白分子量是80、38.5ku;与勘察加帝王蟹血细胞结合的蛋白分子量是80、93ku;与中华绒螯蟹血细胞结合的蛋白分子量是82、41、30ku;与黄道蟹血细胞结合的蛋白分子量是70、43ku。     

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。     

鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠法和苯甲基磺酰氟法提取鱼肠道弧菌外膜蛋白.SDS-PAGE图谱显示,PMSF提取的鱼肠道弧菌有19条带,Sarkosyl法提取的鱼肠道弧菌有14条带,其中111、105、87、78、61、58、53、48、45、40、36、33、32、31 kD蛋白带为2种方法共同条带,101、55、42、27、25 kD为PMSF法特有条带.此外,以制备的兔抗鱼肠道弧菌全菌血清为第一抗体,应用Western-blotting技术分析了鱼肠道弧菌外膜蛋白的抗原性,结果显示分子量为106、87、61、58、55、42、36、32 kD的8条蛋白带发生了免疫反应.     

卤虫携带白斑综合征病毒的研究

卤虫是是，蟹苗种培育的关键动物性饵料，查清其能否携带白斑综合征病毒，对培育健康苗种至关重要。2002年7月至10月，自盐田中取野生卤虫，经暂养后选20尾抱卵雌虫，每尾置1个烧杯中，投喂单胞藻，产卵后取出亲体；20d后，每个烧杯中取5尾子一代个体，利用巢式体外DNA扩增技术对亲体和子一代成体进行WSSV病毒检测，检测结果显示：卤虫中可扩增出特异性的，与引物设计吻合的DNA片段；DNA测序分析表明，扩增片段的DNA序列与白斑综合征病毒序列一致；野生卤虫携带白斑综合征病毒的阳性率为58%，实验条件下野生卤虫后代的阳性率为43%，同一家系中，亲代与子代携带病毒的情况不完全一致，不能确实白斑综合征病毒可否通过繁殖，在卤虫世代间进行垂直传播，研究结果表明：卤虫很可能是白斑综合征病毒的携带者，苗种培育和养殖期间投喂卤虫可能造成虾，蟹感染白斑综合征病毒，卤虫检疫是培育健康苗种的关键措施。     

两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）和苯甲基磺酰氟（PMSF）两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

卤虫在WSSV病毒病传播中的媒介作用

2003年8月对卤虫进行投喂(浸泡)感染，并进行中国明对虾投喂实验。各组对虾阳性感染率的单因素方差分析比较结果表明，卤虫可以携带有活性的WSSV病毒粒子，并可通过摄食导致对虾间接地携带病毒，但病毒感染能力有限。卤虫病理切片观察结果显示，攻毒后卤虫细胞核没有显著深染及核肿大现象，但无论是横切还是纵切均显示有上皮脱落、部分组织结构松散、细胞结构不完整现象。本试验确定卤虫成体可以携带WSSV并通过投喂感染对虾，使其潜在携带病毒，仔虾阶段投喂成体卤虫应经过严格检疫，制作含有经过检疫卤虫的微囊饵料作为卤虫及其他鲜活饵料的替代品或许是有效的防病措施。     

鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术的研究

以抗鱼肠道弧菌单克隆抗体为基础,结合流式细胞术,根据荧光信号强弱比例确定检测鱼肠道弧菌时所需单克隆抗体的最优反应量为200μL,最佳反应时间为45min。在最优反应条件下,抗鱼肠道弧菌单克隆抗体可特异性识别鱼肠道弧菌,阳性荧光信号比例达12.9%;对不同密度的鱼肠道弧菌进行重复性试验,变异系数均在5%以内,说明流式细胞术具有较好的精密度;人工感染健康牙鲆试验表明,流式细胞术检测法能快速从发病鱼的鳃、肝、脾、肾、腹水等部位检测出病原菌,而对照组为阴性;本试验建立的鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术为鱼肠道弧菌的快速检测提供了新方法。     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡，是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测，旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％；渤海湾群体35％；辽东湾群体94．7％；海州湾群体47．4％。结果显示，中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体，推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的，笔者认为，只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时，应该重视海区污染的治理，减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法，1pg病毒核酸仍可检测到，为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

以鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri为抗原免疫小鼠,用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,分别采用酶联免疫吸附(ELISA)技术和间接免疫荧光抗体(EFAT)技术筛选强阳性杂交瘤细胞株,亚克隆阳性细胞株,获得5株抗鱼肠道弧菌单克隆抗体(1C6、1D8、2D7、2D10、2E3).Western blotting 分析结果显示,单抗2D10与相对分子质量为44 200、36 700的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;用流式细胞术(FCM)检测单抗强度,结果显示阳性荧光比例为13.63％,阴性对照荧光比例不足1％;人工感染牙鲆试验结果表明,运用该单抗能够建立鱼肠道弧菌的快速诊断方法.     

水产生物病害防治与食品安全探讨

针对经济水产养殖品种连续检测出违禁药物事件,就水产生物病害防治现状及水产食品安全问题进行了探讨,主要阐述了水产病害防治的基本现状,以及在药物防治过程中产生的危害,最后提出了提高水产食品安全的具体措施。