魁蚶Ets家族9个基因的克隆及其在病毒感染应答中的表达分析

Ets蛋白是宿主MAPK信号通路下游的一类可参与调控病毒基因转录复制的重要转录因子。本研究通过基因克隆成功获得魁蚶(Scapharca broughtonii) Ets家族9条基因(分别命名为ETS-1~ ETS-9)，开放阅读框(ORF)大小分别为1065、1290、1569、912、1344、1404、1521、1968和1191 bp，并分别编码354、429、522、303、447、468、506、655和396个氨基酸。系统进化树分类表明，本研究所获得的基因均属Ets家族。对ETS-1和ETS-3的氨基酸序列和三维结构分析表明，其均含有高度保守的ETS结构域。在不同水温条件下，通过人工注射牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)对魁蚶进行感染，并对病毒拷贝数和Ets的相对表达量进行定量分析。结果显示，ETS-1和ETS-3只在高温阳性组中相对表达量显著上调，与病毒拷贝数在高温条件下增长趋势呈正相关；ETS-4和ETS-8只在低温阳性组中相对表达量显著上调，但在高温阳性组中ETS-4和ETS-8的相对表达量与病毒拷贝数呈负相关；初步研究结果显示，从魁蚶Ets基因中筛选出2条Ets基因(ETS-1和ETS-3)，在高温条件下(16±2)℃，其可能参与正向调控病毒OsHV-1的复制过程。本研究为进一步探索魁蚶在夏季因感染牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)而导致的大量死亡提供了科学数据。     

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一，对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中，溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析，结果显示，12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing, ST)分型互不相同，7株为PubMLST数据库已经收录的ST型，5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因，但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征，对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点；不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异，对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。     

鱼类铁限制及相关病原竞争获取铁离子机制研究进展

正铁是所有生命体不可或缺的微量元素之一,它参与到氧气运输、电子转移、能源物质ATP合成、DNA复制及细胞增殖分化等基础生命过程中。对铁元素的共同需求形成了病原与宿主的相互作用关系~([1])。机体内铁离子环境稳态受宿主的严格调控,宿主铁代谢过程中多种分工明细的铁代谢相关蛋白极大地限制了入侵病原对宿主体内铁离子的获取及利用,一定程度上抑制了病原的侵害~([2])。同时,宿主机体中极为有限的铁离子环境促使病原平行进化出多     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因(HbCP2和HbCP3)的克隆与表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase,CP)是参与植物多种生理过程的一类重要的蛋白酶。为探究CP家族基因在橡胶树(Hevea brasiliensis)中的生理作用,本研究从橡胶树胶乳中克隆了两个CP基因的全长cDNA,分别命名为HbCP2(1 245 bp)(GenBank登录号:KF771829)和HbCP3(1 268 bp)(GenBank登录号:KF771830),分别编码约41和40 kD的蛋白质;获得的基因DNA序列全长分别为1 919和1 634 bp,均包含4个外显子和3个内含子;属于木瓜蛋白酶(C1)家族,分别与同属大戟科植物蓖麻(Ricinus communis)(86.86%)及麻风树(Jatropha curas)(84.74%)的一个CP的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,HbCP2在雄花而HbCP3在胶乳中的表达量最高;HbCP2和HbCP3的表达受割胶、伤害、乙烯利、赤霉素和茉莉酸调控,但不同基因对同一种处理或同一基因对不同处理的反应程度存在较明显差异。研究结果表明,HbCP2可能参与橡胶树的环境胁迫应答和细胞组织衰老过程的调控,而HbCP3可能参与橡胶树的胶乳再生调控以及病害胁迫应答。本研究为橡胶树CP基因家族的研究,探讨CP在橡胶树中对胁迫应答和胶乳再生调控机制提供了相关信息。     

牡蛎疱疹病毒囊膜蛋白(ORF111)的基因克隆及表达

本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先，通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列，并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示，orf111编码一种稳定的疏水性蛋白，具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇，同时，氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰–甘氨酰–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后，构建了pET28a-orf111重组质粒，并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后，通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白，为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础，为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。     

基于原位LAMP技术的牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)易感宿主调查

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)给世界双壳贝类养殖业造成了严重的经济损失。10余种双壳贝类陆续被认定为易感宿主，仍有其他几种贝类仅有PCR核酸阳性数据，因确诊证据不足导致其易感性未得到充分评估。原位环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术相对传统原位杂交技术具有灵敏度高、方便快捷、可作为病原微生物感染证据的优点。为了在OsHV-1流行病学调查过程中实现病毒感染的快速检测和确诊，根据已报道的OsHV-1特异性LAMP检测引物，设计内引物，优化反应条件，建立了OsHV-1的原位LAMP检测方法。基于该方法对2019年以来采集的长牡蛎(Crassostrea gigas)、福建牡蛎(Crassostrea angulata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)样本进行检测。结果显示，毛蚶样本的OsHV-1原位LAMP检测结果呈阳性；其他几种贝类部分样本的实时定量PCR (qPCR)检测呈阳性，但原位LAMP检测呈阴性。对毛蚶样本的原位LAMP检测结果分析发现，病毒杂交信号主要分布在外套膜和肝胰腺等器官的结缔组织，推测感染的细胞为成纤维细胞和血淋巴细胞；在闭壳肌和斧足肌肉组织的肌细胞细胞核中也发现较多杂交信号。鳃丝内和周边偶现阳性信号，推测来自渗出的血淋巴细胞。基于原位LAMP技术的OsHV-1检测结果显示，毛蚶是OsHV-1的一种易感宿主，毛蚶结缔组织、肌肉组织和血淋巴细胞对该病毒有强亲嗜性。     

软体动物疱疹病毒及其对贝类养殖产业的危害

中国是贝类养殖大国，30余年来，贝类养殖产量总体稳中有升，但部分贝类的养殖产业因疫病影响出现严重萎缩、甚至消失。20世纪90年代以来，中国多种双壳贝类和杂色鲍(Haliotis diversicolor supertexta)因感染疱疹病毒出现大规模死亡，成为近年来危害中国贝类养殖业的主要病原。经流行病学调查和病原鉴定，引起中国双壳贝类和杂色鲍死亡的疱疹病毒分别为牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)和鲍疱疹病毒(Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1)。贝类疱疹病毒病不仅在中国发生，同时也在全球多个国家、地区传播和暴发，引起全球贝类养殖从业者和科研人员的广泛关注。多国学者从病毒特征、流行病学、诊断技术、生态防控和抗病育种等多个角度展开研究，以期减轻此类病毒对贝类产业造成的危害。大量科研力量的投入使OsHV-1和HaHV-1成为分类地位明确，研究最深入、最全面的贝类病毒性病原。本文对近年来OsHV-1和HaHV-1研究领域取得的主要成果进行总结，重点介绍其在中国和全球范围的发生、传播过程、产业危害和防控措施等。