一株溶藻弧菌H1B6的分离与鉴定

从患病的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)溃疡体表处筛选到一株H1B6优势菌株,根据形态观察、16S rDNA检测、生理生化鉴定结果,H1B6菌株与溶藻弧菌最为接近,而在以16S rDNA序列构建的系统发育进化树模型中,H1B6菌株也与溶藻弧菌菌株聚为一支。Biolog微生物鉴定结果显示,H1B6菌株为溶藻弧菌的可能性为98.6%,确定H1B6菌株为溶藻弧菌。斑马鱼攻毒试验结果显示,H1B6菌株24 h的半数致死浓度(LD_(50))为4.58×10~6 CFU/mL。     

可结合Caco-2细胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白的筛选与鉴定

[目的]筛选可结合Caco-2细胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白。[方法]筛选副溶血弧菌外膜中的黏附蛋白,将Caco-2细胞表面蛋白生物素化并固定于中性卵白素树脂上,进一步利用亲和层析技术来筛选副溶血弧菌的外膜蛋白。[结果]通过LC-MS/MS质谱技术鉴定出3个候选蛋白:ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta和outer membrane protein U。通过对这3个蛋白进行克隆基因和原核表达,成功纯化得到相应重组蛋白。通过进一步的间接免疫荧光试验,发现3种蛋白对于Caco-2细胞均有黏附作用。[结论]推测ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta和outer membrane protein U这3种蛋白可能是潜在的黏附因子。     

副溶血弧菌与肝素结合相关黏附蛋白的鉴定

黏附因子在病原菌的致病过程中发挥了重要作用,鉴定新的黏附因子是了解病原菌致病机制的重要手段。本研究中首次发现游离肝素能够竞争性抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,表明细胞外基质中的肝素可能是细菌重要的细胞表面黏附受体。进一步利用肝素亲和层析技术垂钓到6种副溶血弧菌的外膜蛋白,并通过基因克隆和原核表达技术成功获得重组的外膜蛋白并对其进行了深入研究。重组蛋白IMPDH、EF-Tu和Opp A可黏附Hela细胞,并可以显著抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,说明这3种蛋白可能是其重要的潜在黏附因子。     

半滑舌鳎源哈维氏弧菌分泌蛋白HutZ的功能鉴定及免疫原性

哈维氏弧菌为我国海水鱼类养殖过程中的常见病原,为了进一步探究哈维氏弧菌的致病机制,本实验分别从前期筛选到的哈维氏弧菌强毒株H2LB1和弱毒株H1SAI3中提取胞外产物(ECPs),并通过蛋白质组学进行差异蛋白鉴定。从中选取了哈维氏弧菌强毒株特异性蛋白HutZ为研究对象,对其功能和免疫原性开展深入研究。首先利用qRT-PCR检测了哈维氏弧菌在不同铁源培养基培养条件下的HutZ基因表达量差异,进一步将克隆HutZ基因连接到原核表达载体上,并在大肠杆菌中成功表达出重组HutZ蛋白。将纯化的HutZ蛋白与血红素共孵育,检测发现该蛋白能够结合血红素并改变其光吸收峰。将HutZ蛋白乳化后免疫半滑舌鳎2次,以间接血凝法检测免疫后1—7周的血清效价,同时在免疫4周后进行攻毒检测其免疫保护率。研究表明,HutZ蛋白免疫后的半滑舌鳎抗体效价最高可达1∶128,攻毒免疫保护率达73.3%,说明HutZ蛋白可作为开发预防半滑舌鳎感染哈维氏弧菌的亚单位疫苗的有效候选抗原。