缢蛏早期耐高温家系建立及抗氧化能力测定

为筛选缢蛏(Sinonovacula constricta)耐高温新品系,该实验以缢蛏新品种申浙1号为基础群,先期建立了16个全同胞家系,并在第2、8、22、36日对各家系的生长进行了监测,在稚贝期分别挑选了3组壳长较长和3组壳长较短家系进行了半致死温度试验与抗氧化能力测定。结果表明:家系6、14在稚贝期的成活率显著高于其他家系(P<0.05),其中家系14的成活率最高;在半致死温度试验中,家系16的半致死温度最高达到36.64 ℃,且壳长较长家系与壳长较短家系半致死温度差异显著(P<0.05);各家系过氧化物酶(POD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)随温度升高而升高,壳长较长家系的3种抗氧化能力在高温下均显著高于壳长较短家系(P<0.05)。通过家系选育和高温实验挑选具有抗逆性的耐高温后代,并通过抗氧化能力的测定在生理生化角度证明了家系挑选的必要性。在综合评估了各家系的壳长、存活率、耐热性和抗氧化能力等数据后最终确定家系14是适合生产的最优家系,家系15、16可用作备选家系。     

缢蛏热休克转录因子1(HSF1)基因克隆、组织表达及功能

热休克转录因子1 (HSF1)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究海洋滩涂生物在耐受高温过程中HSF1发挥的作用和分子机制,进一步阐述HSF1的生理功能,文章以缢蛏(Sinonovacula constricta)为实验材料,利用RACE技术克隆HSF1基因。结果显示,缢蛏HSF1基因的cDNA全长2 026 bp,开放阅读框(ORF)长1 707 bp,编码568个氨基酸,5'非编码区(UTR)长196 bp,3'UTR长123 bp。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示缢蛏HSF1基因与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,HSF1基因在各个组织均有表达,其中在外套膜中的相对表达量最高,其次是鳃、肝胰腺和水管,在斧足和性腺组织的相对表达量较低(P0.05)。荧光定量结果显示HSF1基因在急性温度胁迫后第9小时表达量较高。推测HSF1基因参与缢蛏的热应激过程,并起到一定作用。     

缢蛏α-淀粉酶基因外显子区域SNPs筛选及其与生长性状关联性

α-淀粉酶是广泛存在于生物体内的消化酶,主要参与生物体内碳水化合物的代谢,为生物体提供维持生命、生长发育和繁殖所需的能量。为研究α-淀粉酶基因外显子与缢蛏(Sinonovacula constricta)生长性状的相关性,实验采用PCR产物直接测序法对其进行筛选比对,共获得18个候选SNPs位点,分别为:Rs-1:48G/C、Rs-2:247 C/A、Rs-3:420 A/G、Rs-4:441C/T、Rs-5:537 G/T、Rs-6:837 G/T、Rs-7:936 A/G、Rs-8:952A/C、Rs-9:1047 T/G、Rs-10:1062 C/T、Rs-11:1287C/T、Rs-12:1350 A/C、Rs-13:1362 C/T、Rs-14:1371 C/T、Rs-15:1503T/C、Rs-16:1536 T/C、Rs-17:1737T/C、Rs-18:1788 C/T。随机选取同批繁殖、同塘养殖的缢蛏快长新品种"申浙1号"群体,运用MassARRAY质谱检测方法进行SNPs位点的分型,结果显示:除Rs-13位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05),Hardy-Weinberg平均值为0.581;多态信息含量平均值为0.237。基因型与生长性状的关联性分析结果表明:Rs-5:537 G/T与Rs-10:1062 C/T位点基因型个体之间部分性状存在显著性差异(P <0.05)。13个位点组成的双倍型与生长性状的关联性分析显示:双倍型S6的壳高高于S3、S5、S7(P <0.05),S6的总重大于S7(P <0.05);另外,S6各个生长性状值在所有双倍型中最高。获得的缢蛏α-淀粉酶编码区外显子与生长性状相关的SNPs标记,可为缢蛏遗传改良特征标记筛选及定制培育提供有益参考。     

缢蛏快长选育系早期生长性状的遗传参数估计

采用平衡巢氏设计方法,按照1雄配2雌的方式,构建缢蛏7个半同胞家系和14个全同胞家系,分别测定各个家系60日龄、90日龄及150日龄的壳长、壳高。雄内雌间半同胞个体间具有较大的变异程度,存在显著的母性效应,故以父系半同胞组内相关法计算的狭义遗传力为缢蛏快长选育系生长性状遗传力的无偏估计值。60日龄、90日龄和150日龄壳长的狭义遗传力分别为0.298、0.541、0.574;60日龄、90日龄和150日龄壳高的狭义遗传力分别为0.139、0.519、0.518。壳长和壳高在3个日龄的遗传力属于中等遗传力水平,显示出较高的选择育种潜力。缢蛏幼贝壳长、壳高两个指标间的遗传相关和表型相关均为正相关(P0.05)。60日龄、90日龄和150日龄壳长-壳高性状间遗传相关系数分别为0.980、0.755、0.942,表型相关系数分别为0.910、0.882、0.912。表明缢蛏幼贝期以壳长或者壳高作为选育参数进行选择育种,可达到改良缢蛏快长选育系生长性状的效果。     

不同月龄缢蛏新品种数量性状的相关与通径分析

为了检测缢蛏新品种"申浙1号"不同月龄数量性状间的相关性。随机选取4、9、11月龄缢蛏个体60个以上,测量其壳长(SL)、壳高(SH)、壳宽(SW)、活体质量(W),采用相关与通径分析方法分析壳形态性状对活体质量的作用效果。结果显示,各数量性状之间的相关关系均达到极显著水平,其中与4、11月龄质量相关系数最大的是壳长,分别为0.911、0.631,与9月龄活体质量相关系数最大的是壳高,为0.653。通径分析结果显示,对4、9、11月龄活体质量的直接影响最大的分别是壳长(0.562)、壳宽(0.433)、壳高(0.394),决定系数与以上通径分析结果的变化趋势一致。利用逐步回归的方法分别建立4、9、11月龄缢蛏活体质量(W)的最优回归方程:W4=–0.756+0.039SL+0.112SW,R2=0.849;W9=–10.622+0.095SL+0.404SH+0.644SW,R2=0.631;W11=–23.772+0.207SL+0.805SH+0.587SW,R2=0.909。研究结果为缢蛏人工选育过程中的亲贝选择和产量预测等提供了基础数据。     

缢蛏新品种“申浙1号”ScHsc70 基因SNPs筛查与耐高温性状的关联性分析

为获取缢蛏ScHsc70基因单核苷酸多态性位点与耐高温性状的相关性,通过直接测序方法克隆了ScHsc70基因全长序列,长度为4 048 bp,包括6个内含子和7个外显子,编码区1 950 bp,从其外显子区域筛查到6个潜在的SNPs,分别命名为Rs1(g. 588 CT)、Rs2(g. 840 CT)、Rs3(g. 885 TA)、Rs4(g. 1233 AG)、Rs5(g. 1467 TG)、Rs6(g. 1482TC)。利用Sanger测序方法,对缢蛏新品种"申浙1号"耐高温群体和对照组群体潜在SNPs进行基因分型,遗传多样性分析结果显示,两个群体的多态信息含量(PIC)值在0.111 2～0.371 8之间,对照组群体的平均多态信息含量(0.267 0)高于耐高温群体的平均多态信息含量(0.236 5)。ScHSc70基因SNPs与耐热性状关联分析结果显示,Rs1、Rs3和Rs4的基因型频率和等位基因频率在对照组和耐高温群体之间存在显著性差异;单倍型连锁不平衡分析结果显示,ScHsc70基因SNPs可形成2个单倍体块,7种单倍型,其中CCT单倍型与耐高温性状显著相关;本实验发现,Rs2和Rs3处于连锁状态(r~2=0.86,LOD=25.56,Dx=1.0),可以作为缢蛏与耐高温遗传育种的SNP标签。综上所述,Rs1、Rs3、Rs4和单倍型CCT均可作为缢蛏耐高温遗传育种的候选辅助分子标记,为后续的抗逆性相关SNPs筛选与功能验证奠定了理论基础。     

缢蛏苗水泥池中间培育试验

为了缩短缢蛏中间培育周期,快速培育大规格商品苗种,试验稚贝放养的适宜规格和密度,2016年11月至2016年12月,在250 m~2的露天大型水泥池培育稚贝,并混养少量脊尾白虾。研究了不同泥土厚度(3cm、6 cm),养殖密度对大、小2种规格稚贝的壳长、壳高、体质量和存活率的影响。底泥厚度影响稚贝体形的生长,规格越大所需底泥厚度越厚,大规格稚贝在6.0 cm和3.0 cm的壳长分别为20.25±0.03 mm、18.58±0.06 mm(P0.05)。大、小规格稚贝的存活率分别为81.83%±0.69%、65.74%±0.83%;养殖密度影响稚贝的生长速度,稚贝规格和养殖密度的综合效果显示,大规格稚贝(10万粒/kg、壳长0.890±0.024 cm)适宜的放养密度为1.0~1.5万粒/m~2;小规格稚贝(20万粒/kg、壳长0.488±0.035 cm)适宜的放养密度为3.0~5.0万粒/m~2。培育30 d后,14.4 kg大规格稚贝收获196.4 kg,96.6%达到1.5~2.0 cm商品苗种;8.8 kg小规格稚贝收获苗种144.6 kg,68.4%达到1.5~2.0 cm商品苗种。探究了稚贝在水泥池进行中间培育的可行性,缩短了中间培育周期,能为缢蛏的规模化、集约化养殖提供优质、健康的大规格苗种。     

瘤背石磺钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)基因的克隆及组织表达

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中Ca MKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述Ca MKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆得到CaMKⅣ基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和q RT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺Ca MKⅣ基因的c DNA全长1 603 bp,开放阅读框为1 032bp,5′非编码区315 bp,3′非编码区256 bp,共编码343个氨基酸;预测该基因编码的多肽链原子数量是5 490,分子量约为3.87 ku,理论等电点6.12,分子式为C1741H2768N452O514S15,N端信号肽由1～29个氨基酸组成。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因与加州海兔、光滑双脐螺CaMKⅣ基因的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,CaMKⅣ基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经节组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测,该基因在瘤背石磺的神经调节中发挥重要作用,或为生物机体感知外界环境变量因素的分子基础。本实验为今后进一步了解瘤背石磺神经结构生理功能的调节以及与CaMKⅣ基因功能研究奠定理论支撑,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供参考。