光裸星虫Hsp90基因的全长克隆及其在全组织和卵母细胞中的表达分析

热休克蛋白Hsp90在蛋白质正确折叠、胞内物质运输、细胞增殖调控、配子发生等过程中发挥重要的作用。本研究利用RACE技术克隆获得了光裸星虫热休克蛋白Hsp90 (SnHsp90) cDNA全长序列。SnHsp90全长3110 bp，其中，3´UTR为582 bp，5´UTR为72 bp，开放阅读框为2456 bp，编码818个氨基酸。序列分析结果显示，SnHsp90蛋白具有1个信号肽，存在B型Hsp90的3个标签序列FLREL、IGQFGVGFYS、LPLNVSRE以及保守模块GxxGxG，表明SnHsp90属于Hsp90B亚族。与其他物种的Hsp90氨基酸序列比对发现，SnHsp90与鸭嘴海豆芽(Lingula anatine) Hsp90相似度最高，为77.72%。三维结构建模发现，Hsp90在不同物种之间的空间构象具有较高保守性。系统进化树分析显示，SnHsp90先与小头虫(Capitella teleta)、水蛭(Helobdella robusta)等环节动物的Hsp90聚为一支，再与鸭嘴海豆芽等其他无脊椎动物聚为一大支，而脊椎动物聚为另一大支，表明SnHsp90与小头虫Hsp90亲缘关系最近。RT-PCR结果显示，SnHsp90在光裸星虫的体壁、收吻肌、肾管等组织中均有表达。SnHsp90也可在卵母细胞不同发育时期表达，其中，在卵黄旺盛合成前期(Egg2)和外排卵母细胞期(Egg6)显著高表达(P<0.05)，暗示，SnHsp90可能参与到光裸星虫卵母细胞的蛋白质正确折叠、卵黄合成与环境抗逆等过程。研究结果为进一步探究光裸星虫卵母细胞发育的分子机制积累了基础资料。     

光裸星虫CyclinB基因克隆及其在卵母细胞中的表达分析

【目的】探究细胞周期蛋白B （CyclinB）基因在光裸星虫（Sipunculus nudus）卵母细胞发育成熟过程中的作用,为揭示光裸星虫卵母细胞发育的分子机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆光裸星虫CyclinB（Sn-CyclinB）基因cDNA序列,通过ProtParam、DNAMAN 9.0、COBALT、SOPMA、Phyer2、Pfam及BLAST等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期的表达情况。【结果】Sn-CyclinB基因cDNA序列全长2468 bp,包括141 bp的5'端非翻码区（5'-UTR）、1097 bp的3'端非翻码区（3'-UTR）及1230 bp的开放阅读框（ORF）,编码409个氨基酸残基,在3'-UTR中存在3个胞质多聚腺苷酸化元件（CPE）、1个翻译调控元件（TCE）和1个K-box翻译调控元件。Sn-CyclinB蛋白分子量为46.304 kD,理论等电点（pI）为8.68,具有CyclinB特征序列（FLRRxSK）和Cyclin降解框（RxALGxIxN）,属于亲水性蛋白,含有周期蛋白框（Cyclin box）;其二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占56.72%、3.91%、0.73%和38.63%;CyclinB蛋白C端的保守性较N端高;与其他物种相比,光裸星虫Cyclin降解框（RALGTISN）的位置前移了13个氨基酸;光裸星虫与小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白三级结构高度相似。基于CyclinB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树分为无脊椎动物和脊椎动物两大支,其中光裸星虫与小头虫及水蛭等无脊椎动物聚为一支。Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期均有表达,且整体上呈双峰型变化趋势,其相对表达量的峰值分别出现在卵黄旺盛合成后期（O3）和肾管发育时期（O5）。【结论】Sn-CyclinB蛋白具有CyclinB特征序列,其3'-UTR含有多种与翻译调控相关的调控元件,参与光裸星虫卵母细胞减数分裂G1/S期和G2/M期的转换,对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。