低温驯化下斑马鱼LINE1的表达检测

长散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,LINE1)是跳跃基因。前期比较基因组研究发现,南极鱼经历漫长的低温适应进化后,与南极圈外的同亚目鱼类相比较,在基因水平上LINE1的扩增效率高达8~300倍,但LINE1的扩增与鱼类抵御寒冷之间的关系尚未明了。本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行了不同时间梯度的低温处理(18℃、5 d和18℃、30 d),同时对斑马鱼成鱼也进行了不同时间的低温处理(10℃,3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR检测了LINE1的mRNA水平,并克隆了斑马鱼LINE1基因启动子区,利用Luciferase双荧光报告系统,在ZF4细胞中验证LINE15’UTR在低温压力下的生物活性。结果显示,短时间低温处理下,ZF4细胞中LINE1 mRNA水平有所降低,而在长时间低温处理中,LINE1的mRNA水平显著升高。在成鱼中,短时间低温处理下,LINE1 mRNA水平降低;长期低温处理下,LINE1 mRNA水平显著升高。在ZF4细胞中发现,LINE15’UTR具有生物活性。在低温处理(18℃,3 d)下,报告基因信号减弱,间接表明LINE1启动子活性减弱。研究结果表明,低温压力会影响LINE1在鱼类中的表达。本研究为进一步探究LINE1在鱼类适应低温环境中的作用机制奠定了基础。     

低温胁迫诱导斑马鱼ZF4细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响

为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species,ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d)ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示:(1)DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P0.05)和(2.31±0.08)倍(P0.05)。(2)Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞ROS的产生;通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现p-JNK、p-p38和γH2A.X激活时间点与低温诱导ROS表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。     

HSP90抑制剂根赤壳菌素对斑马鱼胚胎发育的影响

为研究热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育中的作用,本实验采用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的HSP90抑制剂根赤壳菌素(radicicol)对斑马鱼发育期胚胎进行处理,监测斑马鱼胚胎不同发育时期两个HSP90功能抑制标志基因BAG3(BCL2-associated athanogene3)和HSPB1(heat shock protein beta-1)的mRNA的表达水平,并观察不同发育时期的胚胎发育状况。结果如下:(1)实时荧光定量PCR结果显示,BAG3和HSPB1 mRNA水平在根赤壳菌素处理胚胎12 hpf(hours post-fertilization,hpf)或24 hpf后显著增高,Western blot检测到5μmol/L根赤壳菌素处理胚胎24 hpf后HSP70表达上调,证明该实验条件下HSP90功能受到抑制;(2)根赤壳菌素处理后斑马鱼胚胎发育变缓,胚胎成活率统计显示:2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L根赤壳菌素处理24 hpf胚胎成活率分别是95%、77%、35%,成活率随根赤壳菌素浓度的增高而降低;(3)5μmol/L根赤壳菌素处理72 hpf可见部分个体色素沉积减少、心包膜增大、肌肉萎缩等发育畸形。研究结果证明HSP90在斑马鱼胚胎发育过程中发挥重要的作用,根赤壳菌素在5μmol/L时已达到较佳抑制效果且成活率较高,而且胚胎发育出现了各种形态学变化,为后期研究HSP90调节斑马鱼胚胎发育奠定了基础。