03大菱鲆 T 淋巴细胞酪氨酸激酶（LCK）基因全长cDNA 的克隆及表达分析

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黑麦冬牧70幼穗和未成熟胚愈伤组织诱导及植株再生

将黑麦冬牧70幼穗切段和未成熟胚接种在附加不同激素浓度的改良MS培养基上培养,获得了能多次继代培养的愈伤组织,后者在分化培养基上再生植株.2,4-D和6-BA浓度明显影响愈伤组织质量和诱导率,幼嫩幼穗和较小的未成熟胚愈伤组织诱导率高.幼穗切段在改良MS 1.0 mg/L 2,4-D 200 mg/L谷氨酰胺的培养基上愈伤组织诱导率最高,质量较好;未成熟胚在改良MS 2.0 mg/L 2,4-D 0.1 mg/L 6-BA 200 mg/L谷氨酰胺的培养基上愈伤组织诱导率最高,质量最好.继代培养后的愈伤组织转移到附加200 mg/L谷氨酰胺、1.0 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L TDZ的培养基上可分化出大量小芽.该体系可用于黑麦冬牧70遗传转化和细胞工程育种研究.     

黑麦草幼穗离体培养及植株再生

以多年生黑麦草和一年生黑麦草的适宜发育期(1～3 mm)的幼穗为外植体,在附加适宜浓度2,4-D (1 mg/L)的改良MS培养基上诱导愈伤组织发生,诱导率可达95%.一些愈伤组织在诱导培养基上直接发生不定芽,另一些愈伤组织能多次继代培养并保持高分化能力.后类愈伤组织在转入含有0～0.5 mg/L 6-BA和0～0.5 mg/L 2,4-D的分化培养基后产生大量丛生芽,部分小芽发育成苗.幼穗发育时期、培养基的激素组成明显影响愈伤组织的继代培养和植株再生能力,基因型对愈伤组织诱导率和植株再生能力也有影响.该体系适用于黑麦草基因工程和细胞工程研究,且具有实验周期短、基因型制约小、植株再生率高等优点.     

大菱鲆T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)基因全长cDNA的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列.该序列包含193 bp的5'末端非编码区(5'UTR),1 506 bp的开放阅读框(ORF)和300 bp 3'UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸.系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方纯(Fugu rubripes)和黑青斑河纯(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近.在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-PCR表达分析.结果表明,大菱鲆LCK基因只在正常脾脏组织中表达;在用鳗弧菌感染12 h后,大菱鲆胚胎细胞LCK基因表达增强;在鳗弧菌感染的大菱鲆免疫组织中,只在脾脏中检测到LCK基因表达,鳗弧菌感染48 h后,LCK基因在脾脏中表达最强.这些结果表明,LCK基因在大菱鲆脾脏免疫应答中起着重要作用.     

大菱鲆胰岛素样生长因子-I成熟肽的克隆、重组表达及活性分析

通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性,结果显示,纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。