团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

团头鲂IL-12表达及功能的初步研究

白细胞介素-12（IL-12）是一种连接先天性和适应性免疫系统的重要细胞因子,在免疫反应和炎症反应中均发挥着重要作用。本实验以团头鲂为研究对象,克隆了团头鲂IL-12的4个亚基IL-12A、IL-12Ba、IL-12Bb和IL-12Bc的开放阅读框（ORF）序列,长度分别为588、993、939和837 bp。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果表明,团头鲂IL-12各亚基在检测的10个不同的成鱼健康组织中都有表达,但是在不同组织中的表达模式不同;腹腔注射嗜水气单胞菌后,团头鲂IL-12各亚基在免疫相关组织中显著差异表达;脂多糖（LPS）刺激分离的团头鲂头肾淋巴细胞后,4个IL-12亚基均被快速诱导表达。进一步通过大肠杆菌原核表达系统和变性复性方法得到团头鲂IL-12Bb、IL-12Bc重组蛋白并刺激分离的头肾淋巴细胞,显著上调TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达,表明获得的重组蛋白具有生物学活性。最后对获得的蛋白进行抑菌活性检测,结果表明重组IL-12Bb、IL-12Bc单体蛋白对嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用。综上,本研究结果表明,团头鲂IL-12在调节免疫应答的过程中发挥着重要作用。     

团头鲂TYK2基因的克隆与表达分析

以团头鲂为研究对象,克隆获得络氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)基因的ORF序列,该序列长3 489 bp,编码1 162 aa。团头鲂TYK2基因包含23个外显子和22个内含子,与大多数脊椎动物的基因结构相似。蛋白质结构域预测结果显示,TYK2包含4个结构域:B41、SH2、TyrKc(假激酶区)和TyrKc(络氨酸激酶区)。氨基酸多序列比对和系统进化分析结果均显示,TYK2在进化过程中非常保守。荧光定量PCR结果显示,在健康成鱼中,TYK2在中肾的表达量最高,其次是血液、脾脏和头肾,在肠道、脑、鳃、心脏、肌肉和肝脏中的表达量较低。感染嗜水气单胞菌后,TYK2在脾脏和肠中有相似的表达模式:在感染后4 h显著降低并达到最小值,在12 h显著上升且达到最大值(P0.05);在中肾中,在24 h极显著上升且到达最大值,在36 h极显著降低并达到最小值。以上研究结果表明,TYK2基因在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染的过程中发挥着重要的作用。     

团头鲂SOCS家族基因的分子特征及其对嗜水气单胞菌胁迫的响应

为探究团头鲂细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族基因的序列特征和功能，从NCBI数据库获取socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10个socs基因的cDNA序列，利用ExPASy、SMART等在线网站对其进行生物信息学分析，预测团头鲂10个SOCS的理论分子质量、理论等电点与结构域等分子特性。系统进化（MEGA 6软件）分析结果显示，10个SOCS可分为2个亚族：Ⅰ型亚族包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7与SOCS9，Ⅱ型亚族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a与SOCS3b。半定量PCR结果显示，健康团头鲂10个socs基因在被检测组织中具有明显的组织特异性，socs1、socs2、socs3在多个组织中表达量较高。在嗜水气单胞菌感染后，采用实时定量PCR检测团头鲂socs基因在脾脏、体肾、头肾中的表达量，其中socs1、socs2、socs3a、socs3b表达量均显著上调。结果表明，团头鲂SOCS家族基因的表达模式各不相同，预示其功能的多样性，其中socs1、socs2、socs3在免疫应答中发挥重要作用。