瘤背石磺肌球蛋白重链(MyHC)基因的克隆与表达分析

肌球蛋白是动物体内重要的功能性马达蛋白,调控机体的信号传导、肌肉收缩和细胞器运动,为探究肌肉在瘤背石磺(Onchidium struma)由海洋向陆地进化过程中发挥作用的分子机制,实验以石磺科4种贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)基因cDNA的全长并进行组织表达分析。研究结果显示,瘤背石磺MyHC基因cDNA全长为7566 bp,包括5895 bp的开放阅读框,228 bp的5'端非翻译区,1443 bp的3'端非翻译区,共编码1964个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质由31713个原子组成,分子式为C_(9765)H_(15897)N_(2849)O_(3150)S_(52),分子量约为225.28 kDa,理论等电点为5.56,N端信号肽具有29个氨基酸长度。瘤背石磺MyHC具有2个保守结构域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且亲水性氨基酸集中在Myosin_tail_l区。系统进化树分析显示,瘤背石磺MyHC与光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)MyHC的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MyHC基因在各个组织中均有表达,腹足和背部皮肤表达量最高,腹部皮肤、口球、肺囊中高表达,肝胰腺、蛋白腺、两性腺中微量表达(P0.05)。MyHC基因在瘤背石磺的主要运动器官腹足中高表达,说明肌肉运动对瘤背石磺湿地环境的两栖适应性具有至关重要的作用。实验结果为今后进一步研究瘤背石磺肌球蛋白重链基因进行原核表达及多克隆抗体的制备奠定了良好基础,更为深入探讨海洋无脊椎动物从海洋向陆地进化的研究提供有参考意义的分子依据。     

6个不同产地瘤背石磺肌肉脂质及脂肪酸组成分析与比较

为比较不同产地瘤背石磺(Onchidium struma)肌肉脂质和脂肪酸组成的差异性,采用气相色谱-质谱法(GC-MS)对6个不同产地(分别为江苏省盐城市亭湖区和大丰市、上海市浦东新区和崇明县、浙江省温州市苍南县、福建省厦门市)的瘤背石磺肌肉脂肪酸组成进行了分析研究。结果显示:(1)瘤背石磺肌肉磷脂/总脂(PL/TL)崇明产高达(74.84±1.38)%,显著高于其它产地的瘤背石磺(P0.05);各产地瘤背石磺肌肉中胆固醇/总脂(Cho/TL)和甘油三酯/总脂(TG/TL)含量差异不明显;苍南产瘤背石磺游离脂肪酸/总脂(FFA/TL)含量最高;(2)苍南产瘤背石磺的总饱和脂肪酸(ΣSFA)含量显著高于其它产地石磺(P0.05),总单不饱和脂肪酸(ΣMUFA)和总多不饱和脂肪酸[ΣPUFA(≥18∶2n)]显著低于其它产地石磺,其它5个产地ΣMUFA含量差异较小,各产地ΣPUFA和总高不饱和脂肪酸[ΣHUFA(≥20∶3n)]含量差异较大。浦东产瘤背石磺肌肉的C20∶5n3(EPA)、C22∶6n3(DHA)、ΣPUFA、ΣHUFA均显著高于其它产地石磺(P0.05)。研究表明,6个产地瘤背石磺肌肉中脂质及脂肪酸组成存在较大差异,上海和盐城两地的瘤背石磺含有丰富的人体必需脂肪酸,且DHA+EPA含量较高,营养价值丰富;苍南和厦门两产地的瘤背石磺具有含量较高且有特殊生理活性的脂肪酸。     

四种石磺的脂质及脂肪酸组成分析

为比较分析紫色疣石磺、瘤背石磺、里氏拟石磺和平疣桑椹石磺4种石磺科贝类的脂质和脂肪酸组成,实验采用气相色谱/质谱法对4种石磺的脂肪酸组成进行分析研究。结果显示:1 4种石磺科贝类肌肉组织总脂(TL)主要由磷脂(PL)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(Cho)和甘油三酯(TG)组成;紫色疣石磺肌肉组织中的PL/TL高达73.12%,显著高于其他3种石磺(P0.05);瘤背石磺肌肉组织中的TG/TL达2.75%,显著高于其他3种石磺(P0.05);紫色疣石磺肌肉组织中的FFA/TL高达19.16%,显著高于其他3种石磺(P0.05);2 4种石磺肌肉组织中的脂肪酸组成较为平衡;瘤背石磺和紫色疣石磺肌肉组织中的总饱和脂肪酸(ΣSFA)含量均达35%以上;总单不饱和脂肪酸(ΣMUFA)含量从大到小的顺序依次是瘤背石磺(20.63%)、紫色疣石磺(20.49%)、里氏拟石磺(19.61%)、平疣桑椹石磺(19.42%);平疣桑椹石磺肌肉组织中的总多不饱和脂肪酸含量(ΣPUFA)达34.25%,显著高于其他3种石磺(P0.05)。4种石磺中的C20∶5n3(EPA)含量均大于C22∶6n3(DHA)的含量。研究表明,4种石磺的脂质和脂肪酸组成存在较大差异,可能与其生存环境以及生活习性的差异有关,4种石磺的肌肉组织具有较高的脂类营养价值。其中,紫色疣石磺和瘤背石磺含有丰富的人体必需脂肪酸,且营养均衡,适宜食用;里氏拟石磺具有特殊生理活性的脂肪酸成分含量较高。     

瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析

为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。