一种凡纳滨对虾新的C型凝集素基因（LvLc2）的克隆及免疫应答特征

为有效地进行凡纳滨对虾病害防治和健康养殖,探究对虾天然免疫机制,为其免疫防控提供新思路,实验根据本课题组前期转录组结果提示,在凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了一个新的C型凝集素基因(LvLc2, GenBank登录号KR020738)。生物信息学分析显示,LvLc2的ORF区全长465 bp,编码154个氨基酸(aa),5′-UTR为11 bp,3′-UTR为126 bp;其预测的分子量为17.16 ku,理论等电点为4.54;推断其氨基端含有一个由17个aa组成的信号肽序列,羧基端含有一个保守的糖识别结构域(CRD)。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达,其中在肠道中表达量最高,其次为胃、肝胰腺、血细胞等组织或细胞,在肌肉中表达量最低。利用脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)刺激对虾后,比较分析了LvLc2的表达变化特征,不同类型的病原表面多糖可在刺激后不同时期引发LvLc2基因的应答改变,表明其具有潜在的广谱应答模式,同时针对不同病原又具有不同的表达特征,显示了其识别结合和间接免疫效应的差异。对其作用特征的探讨有助于更好地了解对虾C型凝集素在病原感染过程中的功能和作用机制。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考,在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。     

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因 (Lv-SPH)的克隆及免疫应答特征

【目的】丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）是一类重要且分布广泛的蛋白水解酶,行使着一系列重要的生理功能,包括参与消化作用、血液凝结、胚胎发育和免疫应答过程等,但在甲壳动物中少见初步报道。对虾的养殖持续面临着病害的困扰,深入开展对虾免疫防御机制研究,将会为寻找抗病新思路提供借鉴。【方法】本研究利用RACE技术克隆获得了一个新的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）丝氨酸蛋白酶同源物（Serine protease homologs, SPHs）基因（Lv-SPH）的全长cDNA序列,通过生物信息学方法分析了其序列特点,并利用实时荧光定量PCR方法探讨了其组织分布特征和应答病毒感染的表达变化模式。【结果】生物信息学分析显示该基因全长1 249 bp,ORF区长1 005 bp,5’-UTR为156 bp,3’-UTR为88 bp,ORF区编码334个氨基酸,氨基端的16个氨基酸为预测的信号肽序列。在线分析软件SMART分析显示Lv-SPH蛋白含有一个Clip结构域和一个高度保守的SP结构域（Tryp-SPc）,后者具有三分子活性催化位点,前两个是组氨酸和天冬氨酸,第三位为甘氨酸。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达,其中在血细胞中表达量最高,在肝胰腺、心脏和肠道中广泛表达,而在肌肉中表达量最低。注射白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, WSSV）后24h时,Lv-SPH基因的相对表达量显著升高,病毒感染后48h达到最高,约为对照组的3倍。【结论】Lv-SPH基因具备典型的SPH家族成员特征,具有一定的组织表达特异性,WSSV可以显著诱导该基因的上调表达,表明它可能参与了WSSV引发的凡纳滨对虾免疫应答过程。【意义】研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考,在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。     

凡纳滨对虾致病菌Shewanella putrefaciens WS13中crp基因无痕敲除体系构建及功能验证

以crp为靶标基因，建立凡纳滨对虾腐败菌株腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)WS13无痕敲除方法，初步研究crp基因对S. putrefaciens WS13生物被膜形成的影响。利用Pir蛋白依赖的质粒p MMB1构建缺失载体，利用质粒pBBR1MCS-2-PaacC1构建回补载体，通过同源重组方法，实现对crp基因的无痕敲除，琼脂糖凝胶电泳和测序比对结果表明成功获得crp缺失株(Δcrp)和回补株(Ccrp)。通过对S. putrefaciens WS13野生型(WT)、Δcrp和回补株Ccrp形成的生物被膜作定量分析，发现突变株Δcrp生物被膜量明显下降，回补菌株Ccrp的生物被膜量相对Δcrp明显上升，揭示crp影响S. putrefaciens WS13生物被膜形成。研究结果表明，质粒pMMB1和pBBR1MCS-2-P_aacC1可用于S. putrefaciens WS13基因无痕敲除与回补，成功实现对靶标基因crp无痕敲除，并证实crp是影响WS13生物被膜形成的关键基因。