凡纳滨对虾肠道益生菌的分离· 筛选· 鉴定

[目的]获得具有拮抗常见病原菌活性、消化酶活性且具有安全性的凡纳滨对虾肠道内源性益生菌。[方法]从健康凡纳滨对虾肠道中经过初步分离与纯化得到1 220株细菌,对分离的菌株进行拮抗试验,并对产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力进行定量和定性研究。对筛选的13株细菌进行了溶血试验和药敏试验,以评价其生物安全性。[结果]共筛选出13株抑菌活性强、产酶能力强且产酶种类多的菌株,最终确定了2株候选益生菌。菌株的16 S rDNA分子鉴定及Biolog系统鉴定结果表明,细菌3号与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei strain WW2,JN993998.1)相似性达到98%,细菌6号与乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109,KC748440.1)相似性达100%。[结论]研究结果为今后益生菌制剂的开发和应用奠定了基础。     

半滑舌鳎溃疡病病原菌的分离、鉴定及其致病性分析

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株，经血平板检验分离菌株的溶血活性，体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株，即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养，检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率，对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示，经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调，说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈，且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%，其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%)，推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验，结果发现，哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%，与细胞水平检测结果相吻合。实验表明，所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性，尤其以哈维氏弧菌致病性最强，并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。     

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响，本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验，饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区，来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征，并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506，其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低，饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高；②在门分类水平上，3组的变形菌门数均为最多，CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门，Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌，Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌；③稀释曲线和Shannon指数结果可见，CK组样品物种丰度和复杂度最低，且Bc组样品丰度和复杂度相对较高；④PCA分析发现，Rc组和CK组样品微生物组成较为接近，结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析，可见相较于荚膜红细菌，蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著，且益生效果更佳。研究表明，饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度，并能抑制弧菌属等有害菌群的生长，提高对虾体质量增加率并降低死亡率，从而达到益生效果，其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。     

Biolog-ECO方法探究饲喂益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物代谢及有效作用时间的影响

以霍氏肠杆菌(E3)和乳酸菌(R3)2株益生菌对凡纳滨对虾进行为期4周的养殖饲喂实验，饲喂后期利用Biolog-ECO方法对实验组及空白组的凡纳滨对虾肠道微生物菌群多样性的差异进行比较分析，以评价益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群代谢功能的影响。结果显示，添加霍氏肠杆菌(E3)或乳酸菌(R3)的实验组，与空白组相比较，平均每孔颜色变化率显著上升，表明益生菌增强了肠道微生物活性；凡纳滨对虾肠道微生物利用各类碳源的整体能力显著增强，表明益生菌可以促进水产动物的代谢功能；肠道微生物多样性指数(包括Shannon、Simpson和McIntosh指数)有明显差异，表明饲喂2株益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰富度。其中，停喂霍氏肠杆菌后第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数显著降低，Simpson和McIntosh指数显著升高；停喂乳酸菌后的第1天和第5天取样结果表明，Shannon指数无显著差异，Simpson和McIntosh指数显著升高；二者在第10天取样的结果中均无显著差异，表明饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾肠道内原有菌群的数量和结构，促进对虾肠道内微生物群落间复杂的相互作用，进而在维持或者促进对虾健康方面发挥着重要的作用，同时也表明此两株益生菌在凡纳滨对虾肠道中停留时间最少为5 d。