低盐胁迫下松江鲈HSPB1、HSPB7和HSPB11基因的表达变化规律

为了探究小分子热休克蛋白基因HSPB1、HSPB7和HSPB11在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用,本研究基于前期转录组数据,获取3个目标基因的序列信息并进行了系统进化分析,利用实时荧光定量PCR技术检测了3个基因在两种低盐胁迫处理下不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)在鳃、肠、肾和肝组织中的表达水平。系统进化分析结果表明, HSPB1、HSPB7和HSPB11基因分别聚类形成独立分支;在各基因分支中,松江鲈与已报道的鲈形目、鲤形目和鳉形目等鱼种共同聚为硬骨鱼类分支。在两种低盐胁迫处理下, 3个基因在鳃组织中的表达量均在12h显著升高,而在肠、肾和肝组织中的表达量则呈现不同的变化趋势。肠组织中,HSPB7和HSPB11在盐度渐变低盐胁迫(盐度变化速率1.1/h)下表达量均显著升高, HSPB1表达量在48 h显著降低;盐度骤变低盐胁迫(盐度变化速率27/h)下HSPB1和HSPB7表达量在24 h显著升高, HSPB11表达量显著降低。肾组织中,HSPB1、HSPB7和HSPB11表达量均仅在盐度渐变低盐胁迫24h显著升高;盐度骤变低盐胁迫下HSPB1表达量显著降低, HSPB7和HSPB11表达量则显著升高。肝组织中, HSPB7无表达; HSPB1表达量在盐度渐变低盐胁迫下无显著变化,但在盐度骤变低盐胁迫下则显著升高;HSPB11表达量在两种处理下均显著升高。本研究比较分析了HSPB1、HSPB7和HSPB11基因在松江鲈应对不同低盐胁迫时表达变化规律的异同,相关结果为探讨小分子热休克蛋白在鱼类应激调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

养殖军曹鱼稚鱼骨骼畸形研究

本研究采用软骨—硬骨双染色技术对常规养殖条件下的军曹鱼(Rachycentron canadum)稚鱼全骨骼进行染色,观察并分析其骨骼畸形发生部位及相应的畸形类型。结果显示,在同一批次繁育的180个军曹鱼稚鱼(25日龄)骨骼标本中,有72个标本存在畸形情况,畸形率为40.00%。骨骼畸形类型共计22种,畸形率由高到低主要表现为米克尔氏软骨畸形、尾上骨缺失、脉棘分叉、基舌骨异位和尾上骨愈合等;所有骨骼畸形均未表现出显著可见的外部形态变化。但正常个体与骨骼畸形个体的全长存在极显著差异(P<0.01)。本研究表明,骨骼畸形对军曹鱼生长产生了影响。本研究为探索鱼类骨骼畸形的发生过程和原因、减少畸形率和优化苗种培育养殖条件提供了理论基础。     

军曹鱼dnd基因cDNA克隆及其在性腺周年发育过程中的表达

本研究通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum) dnd基因(Rcdnd)的cDNA序列,全长1339 bp,其中,5′非编码区59 bp,3′非编码区173 bp,开放阅读框(ORF) 1107 bp,共编码368个氨基酸。Rcdnd氨基酸序列含有1段RNA识别保守基序(RRM)以及4个C端保守结构域(CR1~4),与高体 (Seriola dumerili) dnd的一致性最高(72.3%)。系统进化分析表明,Rcdnd与高体 的同源蛋白亲缘关系最接近。基于半定量RT-PCR的组织表达分布分析结果显示,Rcdnd在性腺中特异表达,在其他组织中均无表达。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,在精巢发育过程(Ⅱ~Ⅴ期),Rcdnd的表达水平呈逐渐上升趋势;在卵巢发育过程(Ⅰ~Ⅲ期),Rcdnd的表达水平先显著升高后趋于稳定,在150 dph (Ⅱ期)时的表达量最高。原位杂交结果显示,不同发育时期性腺组织中,Rcdnd mRNA主要在生殖细胞中表达。在精巢中,Rcdnd mRNA集中表达于精原细胞和初级精母细胞的周缘,次级精母细胞中的杂交信号明显减弱,而精细胞和成熟精子中几乎检测不到杂交信号。在卵巢中,Rcdnd mRNA在卵原细胞中的表达最强,在初级卵母细胞中的表达较弱,其中,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ时相卵母细胞检测到的杂交信号强度无显著差异,且杂交信号均匀分布于细胞质中。研究结果表明,Rcdnd基因可能参与军曹鱼性腺发育过程,上述结果可为揭示军曹鱼两性生殖细胞发生发育的调控机理提供理论依据。     

低盐胁迫下松江鲈ATP1A3和ATP2B1基因的表达变化规律

为了探究Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用,本研究基于前期转录组数据,获取目标基因ATP1A3 (Na+/K+-ATP酶α3亚基基因)和ATP2B1 (Ca2+-ATP酶1基因)的序列信息并进行了系统进化分析。利用实时荧光定量PCR技术检测了松江鲈的鳃、肠、肾脏和肝脏组织中2个基因在2种低盐胁迫处理(盐度渐变处理,盐度变化速率为1.1/h;盐度骤变处理,盐度变化速率为27/h)下,不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)的表达水平。系统进化分析结果表明,ATP1A3和ATP2B1基因分别聚类形成独立分支;在各基因分支中,松江鲈与已报道的鲈形目和鲽形目等鱼类共同聚在硬骨鱼类分支中。在2种低盐胁迫处理下,2个基因在鳃、肠、肾脏和肝脏组织中的表达量呈现不同的变化趋势。鳃组织中ATP1A3表达量在盐度渐变处理下先上升后下降,ATP2B1表达量仅在24 h显著升高;盐度骤变处理下,ATP1A3表达量显著下降,ATP2B1表达量显著上升。2种盐度渐变处理下,肠组织中ATP1A3表达量均在24 h显著下降;ATP2B1表达量在盐度渐变处理下显著上升,盐度骤变处理下在24 h显著上升。在盐度渐变处理下,肾脏组织中2个基因的表达量均在24 h显著上升至最大值;ATP1A3表达量在盐度骤变处理下显著上升,ATP2B1表达量在12 h和48 h显著上升。肝脏组织中2个基因的表达量在盐度渐变处理下均无显著变化;盐度骤变处理下,ATP1A3表达量持续显著上升,ATP2B1表达量在48 h显著上升。结果表明,低盐胁迫处理显著影响了ATP1A3和ATP2B1基因的表达水平,但2个基因的表达量变化规律存在显著性差异。上述结果为探讨Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在鱼类渗透压调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

鲑降钙素对虹鳟鳞组织lncRNA表达的影响

为探明鲑降钙素(salmon calcitonin, sCT)对鱼类骨组织钙代谢过程的调节机制, 对虹鳟(Oncorhynchus mykiss) 幼鱼进行 sCT 腹腔注射, 并在注射后 24 h 采集鳞组织进行转录组测序, 分析其中长链非编码 RNA (long non-coding RNA, lncRNA)表达水平的变化。结果显示, 注射 sCT 后的虹鳟鳞组织中共鉴定出 847 个差异表达的 lncRNA, 其中 247 个表达上调, 600 个表达下调。GO 注释结果显示, 差异表达 lncRNA 靶基因主要被注释到转录调控、运输、信号转导、膜、细胞质、金属离子结合和核苷酸结合等功能中。KEGG 通路富集结果显示, 差异表达 lncRNA 靶基因在硫胺素代谢通路、炎症介质对 TRP 通道调节、血小板活化、谷氨酸能突触、神经营养因子通路、ARVC 通路和 NF-kappa B 信号通路等通路中显著富集。利用实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对随机选取的 6 个差异表达 lncRNA 的表达量进行验证, 结果显示, qRT-PCR 与 RNA-Seq 结果一致。基于上述结果, 本研究筛选到 MSTRG.68909.2、MSTRG.39805.1、MSTRG.121429.1、MSTRG.9137.1 和 MSTRG.43721.1 共 5 个可能参与虹鳟钙代谢的关键 lncRNA, 这些关键基因的筛选鉴别可为探明硬骨鱼类骨代谢的调控机理提供新的切入点, 为虹鳟养殖生产实践提供参考。     

盐度驯化影响虹鳟鳞组织基因表达的转录组分析

合理选择盐度驯化方式是目前虹鳟(Oncorhynchus mykiss)养殖生产所要解决的重要问题之一。本研究通过分析盐度驯化对虹鳟幼鱼外骨骼(鳞组织)中基因表达水平的影响,重点探讨了盐度对鱼类骨代谢的影响机制。首先,分别采集海水(盐度28)驯化7 d和常规淡水养殖(对照)条件下的虹鳟鳞组织,采用Illumina HiSeq 4000测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。以log2|fold change|≥1且P<0.05作为显著差异表达基因(DEGs)筛选条件,共筛选出1714个DEGs,其中,484个基因显著上调,1230个基因显著下调。GO功能注释分析结果显示,上述DEGs主要被注释在细胞膜、细胞质、细胞核、运输、信号转导、金属离子结合和ATP结合等功能中。KEGG通路富集分析结果显示,DEGs在氧化磷酸化、药物代谢–细胞色素P450、蛋白酶体、p53信号通路和心肌收缩等通路中显著富集。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对随机选取的8个DEGs的表达量进行验证,结果显示,RT-qPCR与RNA-Seq结果一致,表明RNA-Seq数据可靠。结果表明,以4/d的盐度提升速率对虹鳟进行盐度驯化,对其Mmp-2、Mmp-9、Acp5b、Alpl、Osteocalcin、OPG和Col12a1等骨代谢相关基因及NF-kB、MAPK-(JNK、p38、ERK1/2和STAT3)、Wnt/β-catenin、BMP/Smads和OPG-RANK-RANKL等骨代谢相关信号通路影响不显著,说明本研究所采用的驯化模式较为合理。本研究结果可为虹鳟的养殖生产实践提供参考,所获得的基因信息、功能注释和通路富集信息可为探究硬骨鱼类骨代谢的调控机理及其应对环境变化的演化规律提供新视角。     

军曹鱼全基因组微卫星特征分析与多态性标记的筛选及应用

为更好地开发军曹鱼(Rachycentron canadum)高多态性微卫星分子标记，本研究基于军曹鱼全基因组测序结果，利用MISA1.0软件对其简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)的位点信息进行检索及分析。结果显示，基因组中共筛选出1~6个核苷酸为重复单元的SSR位点344 820个，其中，以单核苷酸重复序列最多(174 146个)，占SSR总数的50.50%；其次为二核苷酸重复和三核苷酸重复序列，分别占SSR总数的30.23%和14.02%。在SSR包含的重复单元中，单核苷酸重复以A/T类型为主，AC/GT是二核苷酸的优势重复单元类型。军曹鱼基因组SSR核心序列重复次数在4~275次范围内波动，单核苷酸SSR重复数为10的最多，二核苷酸SSR重复次数为6的最多。本研究设置长度≥12 bp为筛选高多态性SSR位点的标准，共获得361 684个位点。在上述位点中随机选取100个候选位点进行基因分型检测，利用从中筛选到多态性较高的10个SSR标记分别对北海、陵水、硇洲、徐闻和三亚5个养殖群体进行遗传多样性分析，145尾个体中共检测到69个等位基因，观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)平均值分别为0.628、0.706和0.653。相关研究表明，军曹鱼基因组中SSR位点类型较为丰富、多态性潜能较高，从中筛选获得的多态性SSR标记可为军曹鱼分子标记辅助育种、群体遗传多样性评价等研究提供有力支持。     

不同发育期虹鳟脊椎骨的显微结构及钙、磷元素含量分析

为揭示虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脊椎骨的形态结构、元素组成等特征在生长发育过程中的变化情况，本研究分别采集4个发育期(分别为幼鱼Ⅰ期、幼鱼Ⅱ期、成鱼Ⅰ期和成鱼Ⅱ期，平均体质量分别为4、35、644和2 129 g)的虹鳟脊椎骨样品，利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测其第1~6节脊椎骨中钙、磷元素含量，并运用显微CT (Micro-CT)技术对其第4~6节脊椎骨进行扫描与三维重建。结果显示，虹鳟第1~6节脊椎骨的钙、磷元素含量在不同发育期均呈先升高后降低的趋势，脊椎骨中钙、磷元素含量在幼鱼Ⅱ期最高；脊椎骨钙/磷摩尔质量比在生长发育过程中显著增加。第4~6节脊椎骨的显微结构扫描结果显示，脊椎骨的骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)随虹鳟的生长呈显著降低趋势；骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁分离度(trabecular separation/spacing, Tb.Sp)在生长发育过程中显著增加；脊椎骨的骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、组织矿物质密度(tissue mineral density, TMD)和骨矿物质密度(bone mineral density, BMD)等指标均在成鱼Ⅰ期中最低，其次为幼鱼Ⅱ期；脊椎骨中BV/TV及TMD在成鱼Ⅱ期中最高，而BMD在幼鱼Ⅰ期中最大。上述结果不仅为虹鳟发育生物学研究提供了基础数据，还可为鱼类年龄鉴定和分类鉴定等研究提供理论依据。     

军曹鱼仔稚鱼脊柱和附肢骨骼的发育特征

为探明军曹鱼仔稚鱼早期脊柱及附肢骨骼的发育特征，本研究采用软骨-硬骨双染色技术，分别利用阿利新兰、茜素红对软骨、硬骨以及1～33日龄军曹鱼仔稚鱼全骨骼进行染色，系统观察并描述其脊柱和附肢骨骼的发育特征。结果显示，军曹鱼脊柱开始发育的标志为7日龄仔鱼中脉弓和神经弓的出现；13日龄稚鱼椎骨、神经弓和脉弓开始骨化；背肋、腹肋分别于17、20日龄开始骨化；29日龄稚鱼脊柱骨化完成。附肢骨骼骨化起始顺序依次为胸鳍、尾鳍、腹鳍、背鳍和臀鳍。胸鳍匙骨于4日龄出现，肩胛骨孔于12日龄出现，同时上匙骨开始骨化；乌喙骨与肩胛骨于20日龄开始骨化；第1尾下骨于5日龄出现，15日龄稚鱼尾杆骨、侧尾下骨和尾鳍鳍条开始骨化，18日龄稚鱼尾下骨开始骨化；腹鳍支鳍骨于17日龄延伸至匙骨，同时腹鳍开始骨化；臀鳍和背鳍于17日龄由前向后开始骨化。研究表明，军曹鱼在13日龄进入稚鱼期，早期发育阶段的骨骼发育特征与其功能性适应密切相关。本研究结果对研究军曹鱼早期骨骼发育与功能适应、优化养殖条件有重要作用。