利用原核及真核表达系统体外表达草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒外突VP56蛋白的研究

草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。     

应用dsRNA测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染

从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病疑似病料提取物感染的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒基因组dsRNA,电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。应用简化的FLAC(full-length amplification of cDNA)技术扩增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序列BLAST分析表明:其中3个基因组片段与GCRV-873第5、9、10片段高度同源,另外1个基因组片段与GCRV-HZ08第11片段高度同源;因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸,但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的病毒总RNA进行RT-PCR检测并测序,结果显示这3个片段与GCRV-HZ08第5、9、10片段均具有99%同源性,表明是由于混合感染而存在两株不同病毒的核酸dsRNA,两株病毒分别命名为GCRV-JX01和GCRV-JX02。首次运用dsRNA测序法检测出了GCRV病毒的混合感染,为草鱼呼肠孤病毒的流行病学和防控提供了一种新的技术选择。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型对异育银鲫背鳍细胞的显微形态与免疫基因表达水平的影响

为研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)体外感染复制特征以及异育银鲫抗病毒免疫应答反应。本实验采用组织块培养法建立了异育银鲫背鳍细胞的原代培养体系。结果显示,在10 d左右可观察到组织块迁移分离出新的单层细胞,3周左右细胞可覆盖底部面积为25cm2培养瓶的底部;经Cy HV-2悬液感染离体培养的原代细胞,3 d后病毒滴度增殖至106拷贝/m L;在病毒感染6 d后出现典型的细胞病变效应;Cy HV-2感染原代细胞后,分析前期通过鱼体水平实验鉴定出的与该病毒感染相关的免疫基因:PNP5a、MPO、MHCⅠ、LYZ-C、IL-11、ITLN、PNP5a和DUSP,Real-time Rt-PCR结果显示大部分基因在细胞水平均有显著性的上调,与鱼体水平实验结果一致。本研究建立了原代培养的异育银鲫背鳍细胞,用于构建体外感染Cy HV-2病毒的细胞模型,为深入研究Cy HV-2的感染复制规律及其与宿主的相互作用关系,以及细胞水平筛选抗病毒药物实验奠定了基础。     

氟苯尼考在鲫和草鱼体内的药代/药效动力学联合参数及其临床给药方案的研究

为研究氟苯尼考在鲫和草鱼体内的药代学、药效动力学联合参数,并制定氟苯尼考对鲫、草鱼的精确用药方案,本实验结合氟苯尼考对致病性嗜水气单胞菌CAAh01的体外药效学研究和口灌不同剂量的氟苯尼考在鲫、草鱼体内药代动力学研究,确定了氟苯尼考防治该致病菌引起的鲫和草鱼细菌性败血症的给药方案。研究结果显示,氟苯尼考对CAAh01菌株的最小抑菌浓度(MIC)为0.5μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为1.0μg/mL,防细菌耐药突变浓度(MPC)为6.0μg/mL,防耐药突变选择窗(MSW)为0.5~6.0μg/mL。按10、20、30 mg/kg体质量剂量对鲫、草鱼口灌氟苯尼考后,在鲫体内,血药浓度大于MPC的维持时间分别为5、8、24 h;AUC24/MIC分别为177.06、265.90、426.50;Cmax/MIC分别为15.59、21.32、31.24。在草鱼体内,血药浓度大于MPC的维持时间分别为0、0、3 h;AUC24/MIC分别为38.60、75.08、121.94;Cmax/MIC分别为4.75、10.08、19.99。研究表明,综合血药浓度维持MPC以上的时间、AUC24/MIC或Cmax/MIC指标,氟苯尼考适用于鲫细菌性疾病的防治,其防突变用药方案为剂量30 mg/kg,每日1次给药,休药期不低于20 d。对于草鱼细菌性疾病的防治,氟苯尼考不宜连续使用。     

基于P-糖蛋白基因表达评价尼罗罗非鱼体内恩诺沙星代谢“首过效应”

为从药物酶的角度建立一种客观评价鱼类"首过效应"的方法,利用荧光定量PCR法测定尼罗罗非鱼(Oreochomis niloticus Linn)肝、肾组织中P-糖蛋白(P-gp)基因表达量,分析了单剂量(40 mg.kg 1)口服给药恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)后,尼罗罗非鱼肠道、肝组织中mRNA水平的相对表达量与ENR血药浓度的时实相关性。实验结果显示:在尼罗罗非鱼肠道、肝组织中,P-gp基因在分子量127 bp处出现了与预期大小相符的特异性扩增片段。对尼罗罗非鱼口灌给药ENR后,ENR能迅速通过肠道进入血浆,其在肠道、肝和血浆中的消除速度较快,其药物时量曲线关系符合一级吸收的二室开放动力学模型。当血浆中ENR浓度达到最高达峰时(1 h),实验组肠道和肝中P-gp基因的相对表达量相对于对照组均表现出显著性差异(P<0.05);当肠道中ENR浓度达到最高峰时(2 h),实验组肠道P-gp基因的相对表达量则表现出极显著差异(P<0.01);当肝中ENR浓度达到最高峰时(2 h),实验组肝P-gp基因的相对表达量与对照组相比则表现出显著性差异(P<0.05)。该结果证实了鱼类P-gp基因参与药物代谢过程,提供了一种从分子水平揭示水产动物体内药物代谢规律的思路。     

利用硫酸铜控制池塘田螺技术

<正>本实验通过测定不同质量浓度硫酸铜溶液对螺蛳的灭杀效果,同时使用半净水试验方法讨论所选取硫酸铜质量浓度对稀有鲫的急性毒性,确定所选取浓度为安全浓度,为硫酸铜用于田螺防控提供技术参考。一、材料与方法1.实验材料15升聚乙烯塑料桶、6升聚乙烯塑料桶、五水硫酸铜、氯化铵均由山西争跃化工药业有限公司提供,分别为蓝色和白色粉末,含量≥96%。     

高度耐药嗜水气单胞菌的定向诱导及其交叉耐药性分析

为了分析比较不同抗生素对耐药嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的诱导效率,从五大类抗生素中各挑选出一种代表性的抗生素,在针对嗜水气单胞菌菌株AH10的防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)的琼脂平板上,分别筛选出五株耐药菌株,并对筛选的耐药菌株进行交叉耐药性分析,制定出这些耐药菌株对常用抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)图谱。结果显示:四环素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、硫酸新霉素、诺氟沙星对AH10的MIC分别为:1.0、0.5、8.0、8.0、0.25μg/m L;MPC分别为4.0、3.0、128、88、2.0μg/m L,分离的耐药菌株对所使用抗生素的MIC均提高100倍以上。4℃划线平板冰箱保存条件下,一个月内个别耐药菌株耐药性下降。在药物筛选压力下,菌株耐药性随着传代次数增多而表现出递增的趋势。同属一类抗生素耐药相关性较高;不同大类抗生素压力下筛选出来的耐药菌株表现出不同的交叉耐药性。     

草鱼细胞蛋白酶亚基β7与草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS12相互作用

为研究草鱼I型呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)非结构蛋白NS12的功能,实验利用酵母双杂交实验、GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)和对GCRV感染过表达宿主蛋白酶体亚基β7(proteasome subunit beta type 7, PSMB7)的草鱼卵巢细胞(grass carp ovarian cell,GCO)中ns12转录水平的表达量进行实时荧光定量PCR检测,研究PSMB7和NS12的相互作用。酵母双杂交实验结果表明,PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12也存在着潜在相互作用。GST-pull-down检测结果证实PSMB7与GCRV编码的膜相关的非结构蛋白NS12存在相互作用;PSMB7过表达能够上调ns12在病毒感染过程中的转录水平表达量;免疫印迹验证NS12对于蛋白降解并不敏感。本实验室先前研究证实PSMB7在病毒感染过程中表达恒定。综上所述,这些结果揭示GCRV NS12与PSMB7存在分子间相互作用,但并没有作为PSMB7的底物。表明其可能竞争性地阻碍蛋白酶体复合物的形成。病毒蛋白干扰蛋白酶体复合物胞内PSMB7的积累可能是其一种针对蛋白酶体介导的先天免疫的免疫逃逸策略。     

我国水产类高等院校微生物学实验教学改革

根据水产类高等院校微生物学实验教学的特点,分析了微生物学实验教学在教学内容、教学方法、教学评价等方面所存在的问题,进而提出了完善水产类高等院校微生物学实验教学的措施,即加强实验教学的重要性,提高教师自身的素质与实验教学的质量;优化实验教学课程,合理安排实验内容,提高学生的综合实验技能;充分利用现代教育技术,更新教学手段,激发学生的学习兴趣;建立以能力考核为核心的微生物学实验教学多元化的考核方式等。