坛紫菜耐高温品系的选育与海区中试

利用人工诱变和体细胞再生技术,选育出可在30℃下生长的坛紫菜耐高温品(Q-1),实验结果表明:(1)在高温(28℃和30℃)下培养15d,Q-1品系的壳孢子成活率分别为76.8%和60.1%,分裂率分别为100%和83%;而对照组野生型(WT)品系的壳孢子成活率分别为15.9%和6.7%,分裂率分别为90.4%和63.8%。Q-1品系的壳孢子成活率和分裂率均远高于WT品系。(2)在常温(24℃)下培养35d的Q-1和WT品系壳孢子苗,在24℃、28℃和30℃组中再分别培养25d,Q-1品系的苗平均体长分别增加了19.4、10.8和2.8倍,而WT品系的苗平均体长分别只增加了7.3、1.7和0.9倍;Q-1品系的苗平均体长分别为WT品系的2.5、5.8和1.9倍。另外,在28℃和30℃中培养15d的WT品系幼苗发生了大面积腐烂;而Q-1品系幼苗没有出现任何烂苗迹象,表现出较好的生长。Q-1品系在海区中试中也表现出很好的耐高温特性。2008年秋季,坛紫菜采苗后遇到了长时间的高温天气,当地传统养殖的坛紫菜野生种发生了大规模腐烂与脱苗,产量大幅度减少;而Q-1品系的苗仍然维持良好的生长势头,没有出现烂苗,取得了高产。由此证实,Q-1品系是既能较快生长又耐高温的品系,有很大的生产应用价值。     

紫菜种内原生质体的融合和融合体再生

利用酶解法分离出野生型叶状体和红色突变体的坛紫菜原生质体以及条斑紫菜野生型叶状体的原生质体，再用聚乙二醇（PEG）法进行种内原生质体融合，当加入原生质体液内的PEG被稀释除去百，原生质体发生融合并形成许多杂合体，种内原生质体融合率坛紫菜为9.7%-12.4%，条斑紫菜为10%-11.5%。PEG分子量在1540-6000之间，随着分子量的提高，原生质体融合率增高，原生质体融合体被挑出来进行单个培养，经过30天培养坛紫菜的一个杂合体（含一个红色原生质体和一个进驻生型原生质体）再生成一个呈红色和野生色的相嵌叶状体，鸸 个含两个红色原生质体的融合体再生成一个在基部和头部均长假根的叶状体，但来自这个再生体的原生质体只长成具有一个假根的叶状体，从原生质体融保体的再生体以及它们无性繁殖体的结果来看，坛紫菜的种内原生质体融合体可能只发生了细胞质融合，而真正的核融合并没有发生，培养15-20天，条斑紫菜的原生质体融合体先再生成细胞团，然后由细胞团释放出许胞子并萌发成正常野生型叶状体。     

坛紫菜自由丝状体移植育苗的初步研究

为建立有效的坛紫菜自由丝状体移植育苗技术,以坛紫菜的2个选育品系"申福1号"和"申福2号"及野生型品系为实验对象,初步研究了自由丝状体的移植量、移植后培养的光密度和温度对贝壳丝状体的生长和壳孢子放散量的影响,结果如下:当自由丝状体移植量为50～500 mg/m2,随着移植量的增加,贝壳丝状体的藻落数显著增加,但移植量如果超过100 mg/m2,贝壳丝状体的壳孢子放散量反而减少。培养光密度在10～50μmol photons/(m2.s)范围内,随着光密度的增加,贝壳丝状体的生长速度明显增快,但壳孢子的放散量却随着光密度的提高而减少。培养温度在15～25℃范围内,随着温度的升高,贝壳丝状体的生长明显加快;在15～20℃范围内,壳孢子放散量随着培养温度的升高而增加,在20～25℃范围内,壳孢子放散量反而随着培养温度的升高而减少。上述结果表明,在坛紫菜自由丝状体移植育苗中,过大的丝状体移植量、过高的培养温度和光密度均会导致贝壳丝状体的壳孢子放散量减少。     

条斑紫菜壳孢子的抗生素敏感性研究

以往研究紫菜细胞对抗生素的敏感性时,常以叶状体的酶解单离体细胞为材料,但由于来自同一个叶状体的体细胞处于不同的分化阶段,离体培养时,体细胞的成活、再生和发育途径均不相同,从而无法准确地判断抗生素对紫菜离体细胞的生长和发育影响。以成活、萌发和发育途径等几乎一致的条斑紫菜壳孢子为研究材料,较系统地观察了3种抗生素对壳孢子的成活、生长和发育的影响。结果表明：卡那霉素能促进条斑紫菜壳孢子的萌发、生长和发育。加卡那霉素培养7 d,26%的壳孢子萌发体,其细胞数多于20个,比对照组多2倍,培养11 d和18 d,萌发体的平均长度分别为对照组的1.6倍和2.1倍。氨苄青霉素能显著地抑制条斑紫菜的壳孢子萌发、生长和发育,造成细胞的分裂速度减缓、叶状体发育异常。加氨苄青霉素培养7 d,80%的壳孢子萌发体的细胞数少于15个,培养11 d和18 d,各试验组的壳孢子萌发体的平均长度均显著低于对照组,并且随着氨苄青霉素浓度的提高,萌发体的平均长度下降。氯霉素对条斑紫菜的壳孢子具有强烈的致死作用。加氯霉素培养7 d,浓度大于100 μg/mL的各试验组的壳孢子萌发体全部死亡;培养11 d,低浓度组（50 μg/mL）的萌发体也全部死亡,90%以上的萌发体的细胞数小于5个。由此得出,氯霉素是开展条斑紫菜基因工程的理想抗性选择压力。     

印度产紫菜Pyropia chauhanii优良品系的选育与特性分析

为培育出藻体薄且适合在我国南方高水温海区栽培的紫菜新品种,利用~(60)Co-γ射线辐照和高温胁迫处理印度产紫菜Pyropia chauhanii野生型品系(PC-WT)的叶状体,分离出优良品系PC-M,随后通过研究2个品系在耐高温性、生长、主要光合色素含量、单孢子和壳孢子放散量等方面的差异后发现,在18和23°C温度组中,2个品系的壳孢子存活率、分裂率和假根发生率均无显著性差异,但在27和29°C温度组中,PC-M品系的壳孢子存活率比PC-WT品系分别提高了250.7%和305.4%,分裂率分别提高了42.4%和67.1%,假根发生率分别提高了86.6%和175.3%;将在23°C下培养30 d的叶状体分别置于18、23、27和29°C下培养10 d,在18、23和27°C组中,PC-M品系的叶状体绝对生长率分别是PC-WT品系的5.1、5.3和7.5倍,特定生长率分别是PC-WT品系的1.3、1.3和1.8倍;在27°C下培养15 d或在29°C下培养10 d,PC-WT品系的叶状体均放散了大量的单孢子,藻体流失严重,仅剩下基部,而PC-M品系的叶状体均没有放散单孢子、藻体形态完整、光泽好、生长速率快,培养至30 d后才发生轻微的卷曲。与PC-WT品系相比,常温组(23°C)的PC-M品系的3种主要光合色素(chl.a、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量以及壳孢子放散量分别提高了39.4%、209.8%、94.8%和36.7%,但藻体的平均厚度反而减少了31.6%。上述结果证实,与PC-WT品系相比,PC-M品系具有藻体薄、色素含量高、生长快、耐高温、壳孢子放散量大、单孢子不放散等优点,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

条斑紫菜6个品系的SRAP分析

为鉴别条斑紫菜不同品系的种质,使用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记对条斑紫菜的5个选育品系和1个野生品系进行遗传分析,结果从35对引物组合中筛选出可扩增出稳定清晰条带的组合11对,共获得131个扩增位点,其中多态性位点125个,多态性比例高达95.42%。6个品系 间的遗传距离为0.364 3～0.867 9,平均为0.593 0。用UPGMA法进行聚类分析,结果将6个品系分为2个群,所反映的亲缘关系与各品系的来源基本一致,说明SRAP 标记技术可以成为条斑紫菜品系间遗传分析的有效工具。在131个多态性位点中,选择扩增出的4个位点构建了6个品系的指纹图谱。另外,通过ME1/EM6引物组合 扩增得到耐高温品系TM-18的特异性条带,经回收测序和重新设计引物,该条带在其丝状体和叶状体DNA中均能稳定地被扩增出来,可用于该品系的种质鉴别 。     

自然条件下的坛紫菜（Pyropia haitanensis）四分体发育与性别表型观察

为探明野生坛紫菜的性别真相以及野外的性别观察与室内遗传杂交实验所得性别结果相反的原因,对可能影响天然坛紫菜性别的几个关键问题进行了研究。结果发现,5.8S rDNA保守区域的序列分析结果证实,野生坛紫菜群体中的雌雄同体与雌雄异体个体均属同一物种。坛紫菜颜色突变体与野生型间的杂交品系在天然条件下栽培所产生的F1叶状体出现了亲本色的分离与重组,95.6%的小叶状体(约5 mm)为由2～4色块构成的颜色嵌合体,它们长大后的每个色块只出现一种性别,颜色嵌合体也是性别嵌合体,该结果与室内杂交实验一致,这表明在自然条件下,坛紫菜的减数分裂位置与性别分离模式均未改变。但在随后的发育过程中,近基部的1～2个色块严重滞育,仅形成肉眼较难发现的小藻块,构成假根和基部,它们基本不成熟,造成嵌合体的绝大部分藻体由梢部的1～2个色块发育而来,嵌合体比例降至42.1%。但即使是雌雄嵌合的个体,由于梢部色块面积通常较大且成熟远早于中、基部色块,在成熟期的初、中期,成熟个体几乎均为梢部色块成熟,表现为单性,在成熟期的晚期,中部色块开始成熟,雌雄同体比例大幅度上升。本研究表明,在天然条件下生长的坛紫菜仍以雌雄同体为主,但减数分裂产物的四分体不均衡发育以及藻体的梢、中、基部的不同步成熟均极大地降低了叶状体真实性别被观察到的概率,单凭肉眼一次性抽检,其性别往往以雌雄异体为主,少数为雌雄同体。     

鲜冻与酸处理对坛紫菜和浒苔苗存活的影响

采用直接鲜冻和酸处理的方法分别对不同大小的坛紫菜和浒苔藻体进行了处理,旨在建立一种可以有效杀死浒苔而保留坛紫菜的简便方法。实验结果表明：体长为1~2 cm的坛紫菜和浒苔幼苗不经干燥直接鲜冻5 d,坛紫菜苗的细胞成活率达到90%左右,而浒苔只有50%,恢复培养30 d,坛紫菜苗生长良好,只有梢部的少量细胞死亡,而浒苔苗则大部分变黄死亡。用pH为2.0的柠檬酸溶液处理体长为5 cm左右的中苗3 min,坛紫菜的细胞成活率仍高达90.9%,但浒苔的细胞成活率只有58.5%,恢复培养30 d,浒苔的生长受到明显抑制,坛紫菜的生长则基本未受影响;用pH为2.3的盐酸溶液处理长度为5 cm的坛紫菜苗,效果更好,处理1 min的坛紫菜细胞存活率高达97%,而浒苔的细胞成活率则低于20%,恢复培养一段时间,浒苔苗全部死亡,而坛紫菜经盐酸溶液处理1 min、3 min和5 min后的叶状体,仍然正常生长,长度明显增加。依据上述研究结果,如果在海上栽培的坛紫菜网帘上出现大量浒苔附生,在紫菜幼苗期（体长1~2 cm）采用直接鲜冻,中苗期（体长5 cm左右）采用盐酸溶液处理,基本可以达到清除浒苔,确保坛紫菜正常生长的目的。     

坛紫菜天然红色变异体的分离与特性分析

在坛紫菜栽培群体中发现一棵红色块与野生色块相嵌的颜色变异叶状体,在实验室进行红色藻块的体细胞再生克隆培养,获得了纯红色变异体。与野生型相比,红色变异体在叶状体的形态、颜色、生长速度、成熟、藻胆蛋白及叶绿素含量等方面均存在着明显的差异。红色变异体的颜色呈铁锈红色,体形宽大,生长速度明显快于野生型,培养400多天仍不成熟。与野生型相比,它的叶状体活体吸收光谱除各吸收峰的峰值有变化外,第4个吸收峰的峰顶(藻蓝蛋白的吸收峰)向短波方向移动了约3 nm,表明其藻红蛋白的结构有可能发生了改变。另外,它的藻红蛋白(PE)和叶绿素a的含量均显著增加,但藻蓝蛋白(PC)的含量有所下降,使得PE/Chl. a和PC/Chl. a的比值较高, 但PE/PC比值较低。培养400 d的红色变异体的体细胞再生体中,正常叶状体和畸形叶状体的百分数分别为78.49%和19.81%,根丝细胞苗占1.7%,未见细胞团出现,说明该变异体的不成熟是由叶状体的细胞分化严重延缓所致。     

坛紫菜体细胞的连续克隆培养和悬滴培养

随着用于分离海藻体细胞和原生质体工具酶的增多,近几年来,海藻单离细胞和原生质体的培养取得了较大进展,特别是对一些经济海藻如海带、紫菜的原生质体培养,国内外均进行了大量研究。严兴洪等把坛紫菜叶状体体细胞的复杂发育分化趋势初步归结成八类,并且建立了坛紫菜叶状体体细胞的分化模型。阐明坛紫菜叶状体体细胞的发育分化规律,不仅能为利用坛紫菜体细胞直接快速采苗,改进传统采苗工艺的新技术提供科学的理论依据,而且对于开展坛紫菜体细胞与其它紫菜间的细胞融合的正确选材以及细胞融合以后的杂种筛选等研究均具较大意义。为此,我们对坛紫菜叶状体体细胞进行了连续数代克隆培养。单个细胞培养在高等植物中已获成功,但在海藻细胞培养中还未见报道,探讨单个细胞培养途径,对开展海藻细胞工程研究具重要价值。结果报告如下: