两株海水鱼肠道芽孢杆菌的分离鉴定及特性分析

为获取具有益生特性的芽孢杆菌(Bacillus)应用于养殖生产,从野生蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)和许氏平鲉(Sebastes schlegelii)肠道内分离筛选出两株芽孢杆菌,分别命名为YB1和YH2,其革兰氏染色均呈阳性,基于形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA序列比对,鉴定YB1为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus YB1),YH2为壁芽孢杆菌(Bacillus muralis YH2)。分析了温度、pH和NaCl含量(w/v%)对YB1和YH2生长的影响,选取蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶特性培养基检测了YB1和YH2的产酶特性,并通过腹腔注射的方式测定了YB1和YH2对许氏平鲉和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的安全性。结果显示:YB1适宜的生长条件为温度15～35℃、pH 5～9、NaCl含量0～2%,最适生长条件为温度35℃、pH 7、NaCl含量0;YH2适宜的生长条件为温度15～45℃、pH 5～9、NaCl含量1%～3%,最适生长条件为温度30℃、pH 5、NaCl含量2%;YB1和YH2均具有产淀粉酶和蛋白酶的特性;YB1在浓度≤1×10~8 cfu·mL~(-1)时对大菱鲆和许氏平鲉均是相对安全的,YH2在浓度≤1×10~8 cfu·mL~(-1)时对大菱鲆是相对安全的。研究表明:YB1和YH2具有作为有益菌应用于海水鱼养殖的潜力,可作为候选菌株开发为芽孢杆菌微生态制剂。     

许氏平鲉体质量与形态性状的表型特征分析

为探究许氏平鲉(Sebastes schlegelii)主要形态性状与体质量的相关性及在三代选育群体间的差异性，以随机采集8月龄许氏平鲉群体内选育F1代、群体内家系选育F2代和F3代为研究对象，本研究每代各选取80尾分别测量了体质量(Y, g)和11个形态性状指标(cm)：全长(X1)、体长(X2)、体高(X3)、头长(X4)、尾长(X5)、尾柄长(X6)、尾柄高(X7)、吻长(X8)、躯干长(X9)、眼径(X10)、眼后头长(X11)，采用通径分析和灰色关联度分析2种方法对许氏平鲉三代选育群体的形态性状对体质量的影响情况进行评价。结果显示，三代选育群体11个形态性状与体质量的相关关系达到极显著水平(P<0.01)或显著水平(P<0.05)。通径分析中，F1、F2代的体高和躯干长对体质量的通径系数达到极显著水平(P<0.01)；F3代的体高和尾柄长对体质量的通径系数达到极显著水平(P<0.01)。采用逐步回归方法建立了三代选育群体形态性状与体质量的多元回归方程，F1：Y=?47.383+17.097X3+ 7.308X9；F2：Y=?34.615+15.779X3+3.901X9；F3：Y=?54.496+21.966X3+7.283X6。灰色关联度分析中，三代选育群体体质量与形态性状的关联度大小及次序存在一定差异，但三代间与体质量关联度最高的前3个性状均为体高、全长和体长。研究表明，2种分析方法得到的影响体质量的主要形态性状有所不同，且在三代群体间也有所差异，但2种方法在三代选育群体中得到的第一主控性状均为体高，说明体高是影响许氏平鲉三代选育群体体质量的最主要的形态性状。本研究可为许氏平鲉选育测量指标的确定提供参考数据。     

蜡样芽孢杆菌YB1对大菱鲆幼鱼生长性能、肠道消化酶、肝脏抗氧化酶及肠道组织结构的影响

为探究在饲料中添加蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) YB1对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼生长性能、肠道消化酶活力和肝脏抗氧化酶活力以及肠道组织结构的影响,本研究选取720尾初始体质量为(3.6±0.7) g的大菱鲆幼鱼,随机分为4组,每组3个平行,每个平行60尾。4组大菱鲆幼鱼在投喂的饲料中分别添加活菌量为0 (对照)、105、106和107 CFU/g的YB1,养殖期为50 d。结果显示,YB1添加量为107 CFU/g时,大菱鲆幼鱼的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)显著高于对照组(P<0.05)。YB1添加量为106 CFU/g组的大菱鲆幼鱼肠道蛋白酶和淀粉酶活力分别提高了57.86%和82.37%,显著高于对照组(P<0.05);YB1添加量提高到107 CFU/g时,脂肪酶的含量显著高于对照组(P<0.05)。饲料中添加YB1对大菱鲆幼鱼肝脏过氧化氢酶活力无显著性影响(P>0.05);YB1添加量为106 CFU/g组的幼鱼肝脏丙二醛含量下降了42.03%,显著低于对照组(P<0.05);实验组大菱鲆幼鱼肝脏超氧化物歧化酶活力相较于对照组有上升的趋势,差异不显著(P>0.05)。YB1添加量为106 CFU/g组的大菱鲆幼鱼肠道肌层厚度增加最为显著(P<0.05),与对照组相比在实验末期提高了68.91%。研究表明,饲料中添加适量蜡样芽胞杆菌YB1具有促进大菱鲆幼鱼生长、提高幼鱼肠道消化酶和肝脏抗氧化酶活力以及改善幼鱼肠道组织结构的作用,推荐添加量为106 CFU/g。     

陆源有机碳对莱州湾浮游动物能量贡献的初步研究

研究了莱州湾浮游动物及其潜在能量来源颗粒有机碳与溶解有机碳的稳定同位素特征,发现颗粒有机碳、溶解有机碳以及浮游动物碳稳定同位素分别为(-23.24±0.52)‰、(-22.93±0.59)‰、(-21.63±0.76)‰。陆源有机碳在颗粒有机碳库、溶解有机碳碳库中的相对含量分别为(58.2±5.7)%、(54.8±6.6)%,均超过海源有机碳相对含量。陆源有机碳对浮游动物能量贡献为(45.2±8.5)%,略低于海源有机碳贡献。海源有机碳在浮游动物体内更为"富集",浮游动物更倾向于利用海源有机碳。陆源有机碳作为补充碳源,为浮游动物提供了额外能量。     

许氏平鲉不同月龄选育群体形态性状的主成分与通径分析

为研究许氏平鲉不同月龄选育群体性状的生长规律特征及形态性状对体质量的影响,采用相关分析、主成分分析、通径分析和多元回归分析方法对12月龄、15月龄和18月龄许氏平鲉个体的全长、体长、头长、躯干长、体高、尾柄长、尾柄高和体质量8个性状进行分析。结果显示,各月龄许氏平鲉性状之间均呈现显著的正相关,其中以全长与体长的相关性最为显著。各月龄许氏平鲉的第一主成分均指向增长、增重因子;第二主成分有所不同,12月龄未提取第二主成分,15月龄和18月龄第二主成分分别指向躯干因子、尾柄因子。12月龄和15月龄许氏平鲉体长和体高对体质量的直接作用均最大(0.340、0.314和0.347、0.324),18月龄全长对体质量的直接作用最大(0.498),各性状对体质量决定程度与通径系数变化趋势一致。各月龄的不同形态性状对体质量最优回归方程的建立,能准确预测体质量的变化。研究表明,由于许氏平鲉生长阶段的不同,各性状的生长速率及所选形态性状对体质量的影响均存在一定差异,建议把体长和体高(12~15月龄)、全长(18月龄)作为育种工作的目标性状,达到有效提高选育效率的目的,为许氏平鲉的选育工作提供理论依据和技术参数。     

许氏平鲉蛋白激酶B (SsAkt)基因的克隆及其mRNA在细菌胁迫后的表达规律

为研究蛋白激酶B (Akt)在许氏平鲉(Sebastes schlegelii)应答细菌胁迫过程中的作用，本研究应用PCR技术对许氏平鲉Akt基因(SsAkt)的编码区序列进行了克隆和特征分析，并应用实时荧光定量PCR技术检测了健康许氏平鲉各组织和细菌胁迫后肾脏、血液和肝脏中SsAkt mRNA的表达规律。结果显示，SsAkt的开放阅读框(ORF)的长度为1 440 bp，编码479个氨基酸，预测其蛋白的相对分子质量为55.80 kDa，理论等电点(pI)为5.64。SMART分析显示，SsAkt蛋白含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域和2个磷酸化位点。同源比对发现，SsAkt与鱼类的同源性较高，与尖嘴鲈(Lates calcarifer)的相似度最高，为99.37%。组织表达分析显示，SsAkt在许氏平鲉健康组织(血液、鳃、肝脏、肌肉、肾脏、脾脏、肠、脑和心脏)中均有表达，在肾脏、脑和血液中的相对表达量较高。许氏平鲉响应细菌胁迫的表达结果显示，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)感染后，SsAkt在3种组织中的表达明显上调，呈先上升后下降的趋势；鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后，SsAkt在3种组织中呈现不同的表达趋势：在肾脏中，SsAkt的表达趋势为先上升后下降又上升再下降，而在血液和肝脏中的表达趋势为先上升后下降。以上研究表明，SsAkt响应了外源微生物对许氏平鲉的胁迫，在抵御外源微生物免疫应答过程中发挥重要作用。本研究结果为许氏平鲉的免疫机理研究奠定了基础。     

莱州湾海域小刀蛏(Cultellus attenuatus)繁殖生物学研究

2013年4月–2014年3月，采用组织学和实验生态学方法研究了山东莱州湾海域小刀蛏(Cultellus attenuatus)的性腺发育、生殖周期、胚胎及幼虫发育。结果显示，在繁殖季节，小刀蛏性别可通过性腺颜色区分，雌性为白色，雄性为黄色；1个生殖周期为1年，性腺发育经历增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个阶段；莱州湾繁殖期为6月中旬–7月上旬。小刀蛏受精卵卵径为50–55 μm，在水温26℃、盐度28的条件下，经24 h发育至D形幼虫，10 d后幼虫发育变态为稚贝。对莱州湾小刀蛏繁殖生物学的研究，可为该海域小刀蛏的人工育苗和增养殖提供科学依据。     

2株海水鱼源潜在益生菌的分离、鉴定及特性分析

为筛选用于微生态制剂研发的海水鱼源益生菌，本研究对海捕野生许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的消化道内壁黏膜样品进行细菌分离纯化，获得80株可培养细菌。使用选择性培养基对菌株的产酶能力进行测定，选取海水鱼常见病原菌为指示菌测定分离菌株产物的抑菌活性，筛选出2株潜在益生菌TS2和TH8，并进行菌株的生理生化检测、16S rDNA序列分析、生长特性及其对宿主安全性的研究。结果显示，TS2产蛋白酶(protease)、淀粉酶(amylase)和脂肪酶(lipase)，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的生长。TH8产蛋白酶和脂肪酶，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌、假交替单胞菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的生长。基于细菌生理生化检测和16S rDNA序列比对，鉴定TS2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TH8为河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)。TS2在温度为15~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~9时生长较快，6 h进入对数期，26 h后进入稳定期；TH8在温度为20~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~12时生长较快，2 h进入对数期，14 h后进入稳定期。菌株对同源宿主的安全性检测发现，TS2和TH8在108 CFU/mL浓度条件下对同源宿主是相对安全的。筛选的枯草芽孢杆菌TS2、河流漫游球菌TH8产酶能力强，其产物能抑制多种病原菌的生长，具有广温、广盐、耐酸碱、生长速度快等优点，可作为候选菌株开发为微生态制剂，研究结果为其在海水鱼养殖业中的应用提供数据支撑。