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1.
环介导等温扩增(LAMP)技术近年来被广泛应用于病原生物的检测.为了解决LAMP反应试剂混合物在室温条件下的储运问题,本研究对添加5%、10%和15%海藻糖(质量/体积,g/ml)的LAMP反应试剂混合物进行冷冻干燥处理,研究了其在4℃、25℃和37℃储藏条件下活性维持的情况.研究结果表明,添加15%海藻糖能最大程度地保护LAMP反应试剂混合物的活性.相对于未经处理的普通LAMP体系混合物而言,添加15%海藻糖并经冷冻干燥的试剂混合物在4℃、25℃和37℃储藏条件下的活性半衰期分别为112.3、36.2和6.2d,分别为对照组的6.5、8.7和2,1倍.在LAMP反应试剂混合物中添加海藻糖并进行冷冻干燥处理成本不高、方法简单,将有助于推动LAMP方法在各领域的大规模推广应用.  相似文献
2.
根据对虾肝胰腺细小病毒(HPV)保守基因序列,设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化反应条件,建立了肝胰腺细小病毒超分支滚环扩增检测方法。实验中采用一步法连接,探针在Taq DNA连接酶作用下,58℃连接40 min、62℃扩增30 min便可以扩增出明显条带。反应特异性验证实验表明,该体系能够特异性地检测出HPV,而不与供试的其他对虾病原发生交叉反应;灵敏度分析结果显示该方法的检测极限为105 copies/μl,与PCR检测方法相比,一步法连接的滚环扩增的灵敏度低两个数量级。该方法反应过程中温度变化次数少,基本都在等温条件下进行,不需要PCR仪,可发展成为在简便实验条件下使用的简易检测方法。  相似文献
3.
采用带正电的尼龙膜作为片基,利用手动芯片点样仪将鳗弧菌6个毒力基因的寡核苷酸探针点样于膜基底上,然后进行紫外交联,制备膜芯片.制备好的膜芯片与6个毒力基因的带有地高辛标记的PCR产物进行杂交,通过观察杂交信号来判断是否含有该基因.通过对膜芯片点样浓度、杂交时间及洗膜步骤进行优化,确定所设计膜芯片最适杂交时间为30 min、点样探针最适浓度50 μmol/L、洗膜过程只需要3步,时间缩短了45 min.  相似文献
4.
为了阐明潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(Yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒 ( Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)7种病原的检测。同时采用16SrDNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示:发病对虾中WSSV呈现强阳性,IHHNV与CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。对分离的编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果表明,3株菌分别与印度格里蒙菌(Grimontia indica) 、交替单胞菌(Alteromonas sp.)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×10^7CFU/ml、1.1×10^8 CFU/ml 与2.3×10^8 CFU/ml, 各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。综合分析认为,导致该次养殖日本囊对虾暴发死亡的病原为WSSV、IHHNV、CMNV合并感染所致,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。  相似文献
5.
对采自天津、浙江和山东等养殖场5个凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的TaqMan探针荧光定量PCR检测,并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重.引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index,PI,W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数.结果显示,4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体[平均体长为(5.37±1.19) cm]的体重指数PI平均值为(5.19±0.26)×10-3 g/cm3,EHP阴性群体的凡纳滨对虾群体[平均体长为(2.49±0.21)cm]为(7.96±0.51)×10-3 g/cm3,根据PI=a·L(b-3)的函数矫正EHP阴性和阳性群体的体长差异引起的PI差值后,同等体长EHP阳性群体的PI值为阴性群体的(70.5±8.7)%,表明同样大小的个体,EHP阳性群体的平均体重比阴性群体平均体重低30%;EHP阳性群体中凡纳滨对虾体长和体重的变异系数是EHP阴性群体的(2.39±0.93)和(2.05±0.86)倍,表现为对虾EHP阳性群体个体大小不均匀;EHP阳性群体体重偏差率是EHP阴性群体的2.34-3.45倍,体长相同时,EHP阳性的体重波动变大.  相似文献
6.
为查明黄头病毒(Yellow Head Virus,YHV)在我国的存在和变异情况,本研究采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物诊断手册》中YHV套式RT-PCR检测方法对2012-2014年采集的299份样品进行了YHV监测,并对部分YHV阳性样品基因进行了克隆测序及系统发育分析.流行病学调查显示,299份样品中YHV的阳性率为11%,我国养殖的中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾以及罗氏沼虾的部分样品中均检出了YHV,中国明对虾和罗氏沼虾是本次调查中新发现的YHV自然宿主,而且YHV在中国明对虾中的检出率最高.对6份较强阳性样品YHV基因组ORF1b内1002 bp的分型片段进行克隆测序和序列分析,序列比对结果显示,阳性样品的YHV与国外报道的YHV的6个基因型相似度为81.0%-90.5%;系统发育分析显示,6份阳性样品归于同一分支,但与已知YHV的6个基因型均不在同一分支内,其与YHV基因1型(YHV-1)亲缘关系较近.对阳性样品YHV基因组ORF3内编码gp116蛋白的一段序列进行克隆测序,得出其序列长度为509 bp,与YHV-1a的545 bp、YHV-1b的383 bp和YHV-2(即鳃联病毒GAV)的476 bp均不同;依据该片段构建的系统发育树显示,6份阳性样品归于同一分支,与YHV已知的6个基因型不同,与YHV-1亲缘关系较近,且与YHV-1a相似度大于YHV-1b.对其中两份样品的ORF2序列进行比对显示,两份样品序列相似性为99.8%,蛋白序列完全相同,与YHV-1的序列相似度为85.9%,与YHV-2相似性为80.9%.样品调查结果对增补YHV的宿主范围有重要意义;YHV核酸检测和序列比对结果表明,感染我国养殖对虾的YHV为一种新的致病株型.  相似文献
7.
根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.  相似文献
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