半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) 2种视黄酸受体RARα和RARγ克隆及组织表达特性

利用RT-PCR和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) 2种视黄酸受体RARα和RARγ的cDNA全长序列，并采用定量PCR技术分析了其组织表达特性。半滑舌鳎RARα cDNA序列全长为1823 bp，编码443个氨基酸；RARγ cDNA序列全长为1959 bp，编码489个氨基酸。同源性分析显示，半滑舌鳎RARα和RARγ同源性高达60.8%，与牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性高达97.0%，具有较强的进化保守性。系统进化分析显示，半滑舌鳎RARα和RARγ分别归属于单独的分支，且与其他鱼类聚合成簇。组织表达分析显示，RARα mRNA在肾中表达量最高，而RARγ mRNA在脾中表达量最高，RARα和RARγ mRNA在其他组织中均有表达，表明半滑舌鳎2种RAR都可能参与多种生理过程调控。半滑舌鳎2种RAR mRNA在有眼侧皮肤、无眼侧黑化皮肤和无眼侧正常皮肤中的表达量依次升高，且发现RARα在正常有眼侧皮肤的表达高于RARγ，而RARγ在无眼侧正常皮肤中的表达显著高于RARα，无眼侧黑化皮肤中RARα表达高于RARγ。RAR基因在有眼侧和无眼侧皮肤组织中的差异表达可能和RA/RAR系统调节体色有关。     

生长轴对半滑舌鳎早期生长发育的调控作用

为深入了解生长轴(GH/IGF axis)对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长发育的调控作用,采用定量PCR方法研究了GH/IGF轴5个关键生长因子(GH、GHR1、GHR2、IGF-I、IGF-II)在配子、胚胎发育和仔稚幼鱼生长过程中的差异表达调控特性。结果显示,这5个生长因子都具有亲本遗传的特性,除GH外,精子中其他4个生长因子转录表达水平均显著高于卵子。在胚胎发育阶段, GH mRNA在胚胎发育各时期均有表达,且在细胞分裂初期和孵化期表达水平较高。GHR1和GHR2mRNA在胚胎发育各时期呈现相似的表达水平变化趋势,除囊胚期和原肠胚期外, GHR1 mRNA的表达量均高于GHR2。IGF-I和IGF-II mRNA在胚胎发育各时期均表达, IGF-I在孵化期表达水平最高, IGF-II在胚体下包2/3期和孵化期表达水平最高。除64细胞期和128细胞期外, IGF-II mRNA的表达量均显著高于IGF-I (P0.05)。在仔稚幼鱼生长阶段, GH mRNA表达水平从孵化后3 d开始显著升高,到6 d时达峰值。GHR1 mRNA表达水平自6 d开始显著升高(P0.05),到30 d达峰值。GHR2 mRNA在3 d、20 d、25 d、30 d和60 d均处于显著高表达水平(P0.05)。IGF-I mRNA在3 d表达水平最高, IGF-II mRNA从6 d开始显著上调表达,并保持较高表达水平至45 d, IGF-II mRNA表达量均显著高于IGF-I (P0.05)。偏相关分析发现:这5个生长因子通过正向协同或负向拮抗作用在半滑舌鳎胚胎发育和仔稚幼鱼生长过程中共同起调控作用。研究结果为深入了解GH/IGF轴对鱼类生长调控机制积累了新的素材。     

半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析

根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37°C下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepa、lepb和gnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。