发根农杆菌介导的白花草木樨毛状根转化体系的建立

白花草木樨（Melilotus albus Medic.ex Desr.）是草木樨最常见的栽培用种之一，具有较强的抗逆性和固氮能力。为了开发一套高效的草木樨转化体系，本研究以白花草木樨为材料，以结瘤基因MaROP6为目的基因，建立了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的高效白花草木樨毛状根转化体系。结果表明：利用该方法可以在两周左右获得毛状根，其发生率可达78%，MaROP6基因的毛状根转化率可达70.8%。qRT-PCR鉴定结果表明，MaROP6转基因毛状根的平均相对表达量为对照的36.87倍。毛状根转化体系的建立为白花草木樨基因功能的验证奠定了基础。     

抗旱节水小麦分子遗传育种研究进展

干旱缺水等自然灾害会导致小麦产量年度间变幅较大,尤其在小麦主产区黄淮地区更为严重。小麦抗旱节水育种是应对干旱的重大措施。本综述对小麦抗旱节水常规育种、抗旱节水分子遗传育种相关性状QTL定位、抗旱相关功能基因克隆鉴定、转基因等方面的研究进展进行了综述。水旱亲本杂交与异地交叉选择是卓有成效的常规育种方法,通过分子标记鉴定了关于根重、根长、胚芽鞘、高水分利用效率等相关性状的大量QTL;42个抗旱相关基因被克隆并进行基因功能分析和验证,均从不同代谢通路上影响着小麦抗旱性;14个来自不同供体的抗旱相关基因被研究者导入小麦品种后,转基因小麦植株的抗旱能力均得到不同程度的提高,部分植株在产量和其它抗逆性方面也得到提高。以上研究进展为抗旱节水小麦分子设计育种提供了理论依据和发展方向。     

大豆PHD家族蛋白的全基因组鉴定及表达特征分析

PHD（Plant Homeodomain Finger）基因家族编码一类锌指转录因子,广泛参与植物的生长发育和逆境应答过程。通过全基因组鉴定获得了95个大豆PHD家族蛋白。通过共线性分析、进化树构建、基因结构和功能结构域鉴定、GO注释分析、不同组织间和非生物胁迫下表达分析等,获得了大豆PHD家族基因复制、家族进化、保守结构域及基因表达等信息。结果表明,大豆PHD基因在家族进化、基因结构和保守结构域上存在较大变异,可能参与Zn ²⁺结合、DNA结合及表观遗传调控等分子过程,参与调控植物生长发育和逆境应答。这些结果为进一步研究大豆PHD家族在生长发育和逆境应答中的生物学功能提供重要线索。     

甜瓜质地差异及相关细胞壁酶活性变化

对两种不同质地类型甜瓜果实发育过程中果肉质地的变化及相关酶活性进行研究。结果表明,花后35~40 d为软、脆两种甜瓜质地形成的关键时期。在该时期,软肉型甜瓜‘NSL’细胞面积与间隙增大,果肉细胞排列疏松,细胞面积为脆肉型甜瓜的115.35%,软肉型甜瓜‘NSL’与脆肉型甜瓜‘XZM’质构参数差异显著,脆肉型甜瓜果实4种细胞壁酶活性总体低于软肉型甜瓜。花后35 d,软肉型甜瓜‘NSL’细胞壁扩展酶基因(CmEXP3、CmEXP5、CmEXP9)相对表达量为最大值,显著高于脆肉型甜瓜‘XZM’。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。     

NaCl胁迫对甜瓜生理指标及相关基因表达的影响

以薄皮甜瓜(IVF05、IVF89)和厚皮甜瓜(IVF117、IVF303)为试材,研究Na Cl(150 mmol·L~(-1))处理对4个甜瓜品种发芽、幼苗生长及相关基因表达的影响。结果表明,在Na Cl胁迫下,薄皮甜瓜IVF89的生长指标受到的抑制作用最大,其发芽率、发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降23百分点、76.24%、46.71%和39.27%;厚皮甜瓜IVF303的生长指标受到的抑制作用最小,其发芽率下降不明显,发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降46.52%、34.86%和23.08%;Na Cl胁迫提高了甜瓜幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,增加了游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白的含量;4个甜瓜品种幼苗的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和SPAD值均显著降低,IVF05、IVF89、IVF117和IVF303的Pn分别下降了64.44%、69.62%、61.23%、60.00%;4个甜瓜品种的卡尔文循环(Calvin)关键酶基因1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(CmRubisco)、3-磷酸甘油酸激酶基因(CmPGK)和叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因(Cm FBPase)表达均显著下调,核酮糖-5-磷酸激酶基因(Cm PRK)表达大多上调;甜瓜耐盐相关基因质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(Cm SOS1)、液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(CmNHX1)、高亲和力K~+转运体基因(CmHKT1)和N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的表达均上调,其中IVF303的基因表达上调幅度最大。通过主成分分析、相关分析和聚类分析等综合分析方法,将4个甜瓜品种分为3类,IVF05和IVF89为盐敏感类型,IVF117为中耐盐类型,IVF303为强耐盐类型。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

芸薹属及其他异源多倍体植物的基因表达特征研究进展

远缘杂交及异源多倍化导致许多重要作物的起源与进化，而芸薹属栽培异源四倍种是研究作物异源多倍化的模式系统之一。异源多倍体是如何调控及协调来自不同二倍体祖先的不同基因组的遗传行为及基因表达，是过去二十年间的研究热点和重要的生物学问题。利用不断发展的分子生物学技术，一方面揭示出芸薹属及其他多倍体物种基因组表现出动态性质，即在形成初期及长期进化过程中持续发生遗传及表观遗传的变化；另一方面发现异源多倍化过程中伴随着大量的基因表达模式改变，包括非加性表达、超亲表达、表达水平显性、部分同源偏向表达、基因剂量平衡效应等现象。上述基因组结构、表观遗传改变以及基因表达模式的调控，使新产生的多倍体得以成功进化为新物种。     

大豆Abhydrolase_3基因家族进化分析

异黄酮是大豆的重要次生代谢物,参与植物与微生物互作。2-羟基异黄酮脱水酶(hydroxyisoflavanone dehydratase,HID)催化2-羟基异黄酮形成稳定的异黄酮。HID属于Abhydrolase_3基因家族,该基因家族具有多种功能,但该基因家族在大豆中的进化模式尚待研究。为了研究Abhydrolase_3基因家族在大豆中的进化模式,本文在大豆基因组中鉴定了62个Abhydrolase_3基因,串联和片段复制是该基因家族主要扩增方式。根据系统进化关系,将大豆Abhydrolase_3基因家族划分为8个亚家族,其中HID所在的亚家族I基因数量最多,并发生多次基因扩增事件。对大豆Abhydrolase_3基因家族结构分析表明,不同亚家族具有不同的基序。多态性分析表明,亚家族Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ具有较高的核苷酸差异,并受到放松的自然选择。基因表达分析表明,除了亚家族II和IV外,其它亚家族的基因在大豆不同组织中有较高表达;亚家族Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ基因受病原菌诱导表达。结果说明HID所在的亚家族I存在基因扩增和功能分化,与病原菌互作相关的基因具有较高的遗传多样性并受病原菌诱导表达。