过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

水稻LRR-RLK基因LP7的克隆及表达分析

LRR-RLK是类受体蛋白激酶RLK家族中最大的亚家族,在调控植物非生物胁迫等方面具有重要作用。为解析水稻LRR-RLK成员LP7(LOC_Os05g24010)在耐低磷胁迫中的作用,从水稻品种日本晴中克隆了LP7全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列,研究其组织表达模式、亚细胞定位及低磷胁迫下的表达变化。结果表明,LP7基因全长2 832 bp,编码943个氨基酸,LP7蛋白具有典型的LRR-RLK成员特征,LP7蛋白与玉米中的同源蛋白NP_001131018同源性比较高,同源性高达77%。组织表达模式分析表明,LP7基因在根、茎、叶等组织中均表达,在叶中表达量最高。亚细胞定位结果表明,LP7蛋白定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR分析表明,LP7基因受低磷胁迫诱导表达,其表达量较正常培养条件下增加15倍。初步推测该基因可能在水稻响应低磷胁迫中具有重要作用。     

硼肥用量对玉米生长发育及产量的影响

以郑单958和豫单606为试验材料,采用盆栽试验方法,探索不同硼肥用量对玉米产量及生长发育的影响。结果表明,施用适量硼肥可促进玉米生长发育,显著提高叶面积指数,使植株干物质积累量增加,同时硼肥能够促进干物质向果穗运输。施用硼肥能够促进玉米穗分化,使雌雄间隔期缩短,显著提高花丝数和花丝生长速率,进而增加穗粒数。施用硼肥显著提高玉米产量,且不同用量对其影响不同,3.33 mg/kg土壤硼肥处理的效果最为显著,郑单958和豫单606分别较不施硼肥处理增产14.3%和17.4%;施用量为13.3 mg/kg时郑单958增产3.5%;豫单606产生中毒症状,产量较对照降低4.4%。     

玉米自交系耐荫性鉴定与评价

以41个玉米自交系为材料,采用大田试验方法,在植株形态建成期设置15%遮荫和不遮荫两种处理方式,研究不同处理下玉米自交系植株形态、物质生产、产量等11个指标以及各指标耐荫系数的变化,并对自交系的耐荫性进行评价。结果表明,遮荫不仅会增加玉米自交系的株高和穗位高,延缓生育进程,而且会降低植株叶面积指数及叶绿素含量,最终影响玉米物质积累及产量的提升。进一步对各指标的耐荫性进行数学统计分析,表明茎干物质、叶面积指数和产量的耐荫系数可作为评价玉米自交系耐荫性指标。筛选出M173、豫82、DH382、618B、P6874、昌7-2、8612A、M753、ZY608、豫1122、PH6WC和M109高度耐荫型玉米自交系;ZY602、ZY606、658、HT60、ZY601、C70、外引-2、四-144、KW7M14、NS501和PH4CV是弱光敏感型玉米自交系。     

玉米叶片表皮蜡质相关性状的全基因组关联分析

为发掘玉米叶片表皮蜡质合成与调控相关基因，以218份由温带、亚热带和热带自交系组成的关联群体为材料，在原阳对其3个生物学重复叶片表皮挂水能力进行调查，利用1.25 M覆盖玉米全基因组的SNPs进行Q、K和Q+K这3种模型下的全基因组关联分析。结果表明，Q模型较K模型和Q+K模型能更好地评价叶片表皮的挂水能力。Q模型下，共检测到88个覆盖玉米9条染色体的显著SNPs（P ≤ 2.04E-6），88个SNPs分布于47个QTLs内，单个QTL可解释13.6%~45.6%的叶片挂水能力表型变异，47个QTL内共有97个候选基因，其中，77个具有功能注释。位于第2染色体上的转录因子NAC77（GRMZM2G018436）和第3条染色体上的亚油酸酯氧合酶（GRMZM2G156861）编码基因，是叶片表皮蜡质性状的重要候选基因。     

玉米穗轴对穗腐病抗性鉴定体系与优异抗源的研究

穗轴作为拟轮枝镰孢菌侵染果穗引发玉米穗腐病的重要途径之一，能够影响病原菌的侵染和扩散。为了深入开展玉米穗轴对拟轮枝镰孢菌抗性的研究以及了解玉米穗腐病子粒与穗轴抗性的差异，进行抗性鉴定体系的优化，利用164份国内外玉米骨干自交系进行两年两点的接种鉴定筛选优异抗源，对发病边长、发病芯长、发病面积、发病相对面积等4个抗性指标进行研究。结果表明，发病边长能较大程度地区分不同自交系间的抗感差异且又在材料内具有较好的重演性。把发病边长确定为玉米穗腐病穗轴抗性鉴定指标，对参试自交系进行抗性评价，鉴定出CML27、BT-1、CML274等58份穗轴高抗自交系，筛选出BT-1、CML173、CML193等8份子粒与穗轴均抗穗腐病的优异抗源。     

PEG-6000模拟干旱胁迫下不同基因型 小麦品种萌发期抗旱性的综合鉴定

为了研究不同基因型小麦品种萌发期的抗旱性,以20个小麦品种为材料,采用质量分数为20%的PEG-6000溶液处理模拟干旱胁迫,测定了芽长、主胚根长、芽鲜质量、根鲜质量、发芽率、发芽势、发芽指数和萌发抗旱指数等指标,通过主成分分析和综合评价值(F值)法对供试材料的抗旱性进行综合评价,并通过测定相关生理指标对评价结果进行了验证。结果表明,PEG-6000胁迫处理后的芽长、主胚根长、芽鲜质量、根鲜质量、发芽率、发芽势、发芽指数均受到抑制,但不同品种的降幅存在显著差异。主成分分析表明,晋麦47、运旱618、长治6406、石4185和旱选10号抗旱性明显强于F值较低的京冬18、石家庄4号、石优20、郑麦366和郑麦9023。相关生理指标测定结果表明,F值较高的晋麦47、运旱618和长治6406的抗旱性要显著高于F值较低的京冬、石家庄4号和郑麦366。这说明基于形态指标的综合评价值法可以有效地对小麦萌发期抗旱性进行鉴定,供试材料中抗旱性较强的品种有:晋麦47、运旱618、长治6406、石4185和旱选10号,抗旱性较差的品种有:京冬18、石家庄4号、石优20、郑麦9023和郑麦366。     

播期对丹参幼苗农艺性状及生理特性的影响

为研究播期对丹参幼苗生长的影响,以河南产丹参为材料,比较了9个播期的丹参幼苗农艺性状及生理指标的差异。结果表明:随着播种时间的推迟,丹参幼苗形态各项指标呈现降低趋势,9月以后播种的丹参幼苗壮苗指数降低至0.01以下。随着播种时间的推迟,丹参幼苗可溶性糖含量依次降低;可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量逐渐升高;超氧化物歧化酶(SOD)活性几乎没有变化。综合各个播期丹参幼苗的生理特性和形态物质积累,丹参育苗应在9月之前。