过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

番茄GRX基因家族的鉴定及表达分析

GRX基因家族是从原核生物到真核生物中普遍存在的一类巯基-二硫键氧化还原酶,在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中均发挥重要作用.本研究在番茄基因组范围内,利用生物信息学方法对番茄的GRX基因组家族的成员、分布及结构和功能等进行分析.预测结果显示,番茄GRX家族包含55个蛋白质,分为4个亚族,其中植物特有的CC亚族成员最多,有35个,其他GRX基因成员与拟南芥GRX家族具有相似分类.在番茄GRX结构域中包含12个重要的基序,主要分布在序列的N端,相同亚族中的GRX成员蛋白序列的氨基酸保守域构成基本一致,且各亚族成员的氨基酸保守域组成特异,表明这些基序的存在对GRX蛋白功能的执行是必需的.利用实时荧光定量PCR对番茄GRX基因的组织表达和胁迫响应分析,结果表明,GRX基因具有组织特异性表达差异,CC型在根和花中表达较高,在果实中表达较低;在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下,22个番茄GRX基因的表达模式被阐明;其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低,很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应.本研究结果将为番茄GRX家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析GRX基因功能奠定基础.     

清代时期汾河中游地区洪涝灾害研究

通过对历史文献资料的搜集、整理和分析,对清代汾河中游地区洪涝灾害的时空变化与形成原因进行了研究。结果表明:在清代268年间,汾河中游发生洪涝灾害104次,平均每2.58年发生一次。清代早期和晚期是洪涝灾害多发期,中期是洪涝灾害较少发生时期。该段流域洪涝灾害的发生主要集中在汾河中上游段支流上的汾阳、文水、介休、清徐、交城5县市。根据涝灾的等级序列得出,清代该段流域2级涝灾发生次数最多,1级涝灾和3级涝灾次之,4级涝灾发生次数较少。最后对洪涝灾害形成原因分析表明,气候变化是汾河中游洪涝灾害发生的重要原因,而人为因素则加剧了洪涝灾害的发生,这为了解汾河中游洪涝灾害长尺度变化规律研究具有重要的现实意义。     

三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化

以三叶木通试管苗下胚轴为材料,研究不同激素配比对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导、分化的影响,比较光照及不同抗褐化剂对防止愈伤组织褐化的影响。结果表明,当2,4-D浓度为2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L时,愈伤组织诱导率高达96.5%;黑暗处理比光照更有利于愈伤组织的诱导,0.6 g/L PVP对预防愈伤组织褐化具有较好的效果;TDZ的浓度对愈伤组织的分化有着重要的影响,适合愈伤组织分化的最佳培养基为:MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L。     

广州地区番茄青枯病菌的系统发育分析及致病力评价

2012~2013年,于广州地区采集番茄青枯病病样并进行病原分离工作,经分子鉴定后获得9个菌株。通过PCR扩增获得了其中9个菌株的egl基因序列,采用国际新兴的青枯菌演化型分类框架进行系统发育分析,以NCBI数据库中分离自不同寄主的青枯菌菌株egl基因序列为参考序列进行系统发育树构建。结果表明:9个菌株属于青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株的4个序列变种,分别为序列变种13、14、34、44。以高抗青枯病番茄材料‘兴农021’和敏感材料‘金冠3号’为试材,评价了其中5个菌株的致病力,结果表明3-1和18-6致病力较高。     

利用重组自交系群体定位玉米种子活力相关生理性状的QTL

种子是农作物生产的物质基础,种子质量直接影响农业生产的成效.种子活力是衡量种子质量和应用价值最重要的指标之一,活力高的种子发芽迅速整齐、幼苗均匀、生长健壮,同时可以节约播种量,减少劳力投入,降低生产成本,提高农业生产效益.QTL定位和克隆是解析玉米农艺性状遗传基础的重要手段.本研究以基于豫537 A×沈137构建的一个RILs群体的212个家系为材料,利用SNP分子标记技术构建的高密度的分子遗传连锁图谱,采用复合区间作图法定位了超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛含量等玉米种子活力相关生理指标的QTL,共检测到11个QTLs,分别分布在第1、2、4、6、7、8条等6条染色体上,单个QTL的贡献率介于5.52％～12.10％之间,这些QTL的确定有助于开展分子标记辅助选择种子活力相关性状.     

番茄‘黄樱桃-2号’再生体系研究

以番茄‘黄樱桃-2号’的子叶切段为外植体，研究不同激素组合对愈伤组织产生以及再生芽诱导的影响。结果表明，不同种类和浓度的激素诱导形成的‘黄樱桃-2号’愈伤组织和再生芽数目存在差异，最适培养基为：MS＋6-BA2．5mg／L＋IAA0．2mg／L，出愈率可达到95．08％，每个外植体再生芽数约为5。最适生根培养基为：1／2MS＋IAA0．2mg／L。通过观察头孢霉素和羧苄青霉素2种抗生素对子叶愈伤组织和再生芽诱导情况的影响，确定‘黄樱桃。2号’子叶的除菌培养基为：MS＋6-BA2．5mg／L＋IAA0．2mg／L＋头孢霉素200mg／L＋羧苄青霉素200mg/L。同时还对作为筛选剂的卡那霉素进行了浓度筛选，确定了卡那霉素对‘黄樱桃-2号’子叶的筛选浓度为50mg／L。     

铁皮石斛丛生芽增殖的均匀试验

通过均匀试验筛选出铁皮石斛丛生芽增殖的适宜培养基,采用U9(95)试验表,考察6-BA、NAA、KT等激素及其浓度对铁皮石斛丛生芽增殖的影响。运用SPSS 17.0软件进行统计学分析,并建立多元回归方程。结果表明,植物激素6-BA、NAA、KT对铁皮石斛丛生芽的增殖均有一定的影响,其中,6-BA>NAA>KT,当6-BA、NAA、KT浓度分别为2.7、0.1、0.1mg·L-1时,丛生芽的增殖系数最大。并分析了不同附加物培养基对铁皮石斛丛生芽增殖的影响,得到最优培养基配方为:1/2MS+2.7 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1KT+0.1 mg·L-1NAA+200 g·L-1土豆汁。     

番茄HDACs家族基因在胁迫条件下的表达分析

组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）家族基因在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中发挥重要作用。利用生物信息学方法对番茄的HDACs家族成员、分布及结构和功能等进行分析。结果表明，番茄HDACs家族包含15个成员，分为3个亚家族。遗传进化分析表明，番茄HDACs家族成员与拟南芥HDACs家族具有相似分类。利用实时荧光定量PCR对番茄HDACs家族基因的组织表达分析表明，HDACs具有组织特异性表达差异，SlHDT1、SlHDT2和SlHDT3在根中表达较高，而SlHDA1、SlHDA3、SlHDA5、SlHDA6在果实发育过程中表达较高；利用RT-PCR对番茄HDACs的胁迫响应分析表明，在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下，15个番茄HDACs成员的表达模式不同，其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低，推测这些基因很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应。结果将为进一步解析番茄HDACs家族基因的功能奠定基础。     

基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测

转基因植物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术并以番茄抗坏血酸过氧化物酶apx(ascorbate peroxidase)基因和光诱导的早期蛋白elip(early light inducible protein)基因为内参开展对12株转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测。研究结果表明:常规番茄使用的内参基因apx在樱桃番茄中可能以多拷贝形式存在;以elip基因为内参检测到转基因植株内整合的拷贝数为0~20不等,其中4株在普通PCR检测中存在假阳性,且80%的转基因植株发生了基因重排现象。