大白菜软腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其防效研究

为筛选对大白菜软腐病具有较好拮抗效果的生防菌株,采用对峙平板法分别从作物根际土、发酵池以及本实验室菌种库得到6株拮抗性较强的菌株ASR-12、ASR-23、ASR-31、ASR-54、ASR-55、ASR-150。在离体叶柄软腐防效试验中,采用注射接种法获得了拮抗性较强的3株拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150,48 h的防效分别达到了87.64%、80.90%和70.79%。温室防效试验的结果表明:菌株ASR-12、ASR-23和ASR-150防治效果分别为59.22%、59.21%和55.00%,显著高于72%农用链霉素可湿性粉剂的防效(39.15%),具有很好应用前景。依据形态、生理生化和分子鉴定,菌株ASR-12被鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。     

解淀粉芽孢杆菌ASR-12抗菌蛋白的分离纯化 及其编码基因克隆

为了从菌株ASR-12发酵液中分离纯化获得抗菌蛋白。将菌株ASR-12发酵液经硫酸铵沉淀、透析除盐后获得粗蛋白,粗蛋白进行热处理和Q Sepharose Fast Flow柱层析,纯化后的蛋白进一步进行LC-MS鉴定,并克隆其编码基因进行测序。粗蛋白经热处理和柱层析后得到5个吸收峰,活性检测结果显示峰Ⅳ具有较高抑菌活性,经SDS-PAGE检测显示为单一条带,分子量约为50k Da。LC-MS鉴定结果显示抗菌蛋白与M42家族肽酶同源性最高,覆盖度达到80%;并能从菌株ASR-12基因组中克隆到M42家族肽酶编码基因,测序结果经BLAST比对与解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2的M42家族肽酶编码基因同源性达100%。菌株ASR-12产生的抗菌蛋白中,M42家族肽酶为主要活性成分。     

解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2对玉米的防病促生长效果研究

通过平板对峙培养及盆栽试验,研究解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(Y2)防治玉米小斑病和茎基腐病以及提高玉米生物量的效果。平板对峙培养结果表明,Y2发酵液、无菌滤液及菌体悬液对玉米小斑病菌和茎基腐病原菌均有拮抗作用。盆栽实验结果显示,3种处理对玉米小斑病防效60%左右,对茎腐病防效50%左右,防效依次为Y2发酵液菌体悬液无菌滤液。单独使用Y2发酵液、无菌滤液及菌体悬液处理的苗根长、株高、鲜重和干重均显著高于清水和病原菌对照20%以上,喷施或灌溉接种病原菌的玉米苗生长量显著高于单独接种病原菌处理,有效消除了病原菌对植株生长的影响。因此,生防菌Y2具有用于防治玉米病害和具有根肥及叶面肥的潜力。     

表面活性素促进枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖能力研究

枯草芽胞杆菌XF-1是一株大白菜内生生防菌,通过叶面喷施的方式可有效防控大白菜根肿病,但其叶际定殖的分子机制尚不明确。为了明确表面活性素对XF-1在大白菜叶际定殖的影响,进一步提高其在田间应用效果,本研究通过测定生长曲线、泳动运动、群集运动和24孔细胞培养板静置培养试验,分析表面活性素对XF-1菌株生长速率、运动能力和生物膜形成水平的影响;利用叶片-微生物互作分析和定殖试验,测定XF-1及突变体XF-1-ΔsrfA在大白菜叶表黏附和植株内的定殖能力。结果表明,XF-1-ΔsrfA与XF-1相比生长曲线没有明显差异,泳动能力和群集运动能力分别显著下降了36.8%和43.9%,静置培养24 h后生物膜形成能力显著下降53.9%,48 h后无显著差异。叶片-微生物互作试验中,突变体标记菌XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率较XF-1-gfp约下降80%。喷施接种3~7 d后, XF-1-ΔsrfA-gfp相较于XF-1-gfp在大白菜叶片内和根系中的定殖数量均显著下降。试验结果表明表面活性素对枯草芽胞杆菌XF-1在大白菜叶际定殖具有较为明显的促进作用,srfA基因的缺失显著抑制XF-1的叶际定殖能力。     

水体中根肿菌孢子实时荧光定量PCR检测体系的建立

【目的】十字花科作物根肿病是一种世界性病害,早期准确定量检测病原是实现有效防控的基础,研究旨在建立一种应用于水体中检测根肿菌的实时荧光定量PCR方法。【方法】采用近年已研究并发表的一对引物。建立并优化RT-PCR反应体系,利用大肠杆菌TG-1、大肠杆菌T1-1、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢杆菌XF-1、解淀粉芽孢杆菌Y2、柑橘黄龙病病原菌、假单胞菌E12、成团泛菌L9、阴沟肠杆菌C6、荧光假单胞菌df等11种病原物进行RT-PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测不同接种浓度的水体中的根肿菌。【结果】得出标准曲线的回归方程为Y=-3. 452X+35. 118,其回归系数R2=0. 996,扩增曲线在1×101～1×107拷贝/μl范围内,具有较好的线性关系,扩增效率94. 833%,相邻扩增曲线间距均匀,1×101拷贝/μl为最低检测值。熔解曲线显示,所有产物具有单一峰形,有高度扩增特异性。重复性试验变异系数小于1%。在人工接种的水体中,检测下限至少为102个孢子/m L。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点,为检测根肿菌在水体中的含量提供了技术方法。     

枯草芽孢杆菌XF-1对十字花科作物体内异硫氰酸苯乙酯含量的影响

利用枯草芽孢杆菌XF-1的发酵液处理十字花科作物大白菜、油菜、红菜苔、大头菜、萝卜、水果萝卜和花椰菜,通过HPLC检测了各作物根部的异硫氰酸苯乙酯含量和黑芥子酶活性.结果表明:未处理的萝卜体内的异硫氰酸苯乙酯含量最高,达2.369 mg/g;经XF-1处理后,各作物根部的异硫氰酸苯乙酯含量均有所提高,以大头菜的提高幅度最大,增长率达122.09％;未处理的水果萝卜体内的黑芥子酶活性最高,达4.587 U/mg;处理后各作物的黑芥子酶活性均有不同程度的提高,以萝卜的增幅最大,增长率达68.33％.说明XF-1可能参与了十字花科作物硫代葡萄糖苷的代谢,从而提高了各作物对根肿病的抗性.     

叶面喷施枯草芽胞杆菌XF-1防治大白菜根肿病

为了建立简易、有效的根肿病生防体系,本研究采用浇灌和喷施枯草芽胞杆菌XF-1的绿色荧光蛋白标记菌株XF-1-gfp,测定其在大白菜植株内的定殖能力,并用野生型菌株XF-1发酵液研究其防治根肿病和挽回产量效果。结果表明,叶面喷施XF-1-gfp发酵液后,标记菌在大白菜根、茎、叶等组织内的密度呈现出"先上升后下降最后趋于平稳"的趋势,最终稳定在约10~3 cfu/g组织;盆栽试验结果表明,与空白对照相比,所有处理发病率和病情指数均显著下降,喷施XF-1发酵液后最佳防治效果为56.4%,浇灌化学杀菌剂10%氰霜唑悬浮剂2 000倍液及1×10~7 cfu/mL的XF-1发酵液防效分别为78.6%与70.7%。大田试验结果表明,喷施XF-1发酵液后防治效果达52.6%,与浇灌化学杀菌剂10%氰霜唑悬浮剂(64.6%)及XF-1发酵液(74.0%)相比无显著差异。此外,与空白对照、浇灌10%氰霜唑悬浮剂及XF-1发酵液相比,喷施XF-1发酵液后大白菜单株产量分别增加了74.0%、35.1%及23.6%。试验结果表明叶面喷施XF-1发酵液是一种有效的防控大白菜根肿病及增产增收的方法。     

3套水稻近等基因系对两个病圃稻瘟病菌的抗性评价

采用苗期喷雾法,评价了丽江新团黑谷、CO39和IRBL系列等3套近等基因系水稻品种对云南省腾冲县和罗平县两个病圃稻瘟病菌的抗性水平及利用价值。结果表明:C101A51(Pi-2(t))、IRBL-22(Pi-9(t))和IRBL-23(Pi-12(t))等3个品系的抗性最强,抗病频率分别为:94.22%、93.50%、90.61%。对2个抗瘟基因的联合抗病性分析表明,Pi-2+Pi-9基因、Pi-2+Pi-12基因搭配的联合抗病性系数达0.88和0.86,在抗病育种中适于聚合应用。     

贵州山豆根根腐病病原菌鉴定

【目的】明确贵州山豆根根腐病的病原菌种类,为山豆根根腐病的防治及抗病育种提供理论基础。【方法】采用保湿培养法和组织分离法对感染根腐病的山豆根植株组织进行病原菌分离和纯化,根据柯赫氏法则对代表性菌株进行致病力测定;结合形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。【结果】从收集的病株组织样本中共分离获得200株真菌菌株,选取在PDA培养基上菌落形态差异明显的67株菌株进行ITS测序并在NCBI数据库进行BLASTn比对分析,结果显示,67株菌株中包含尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）35株、茄腐镰刀菌（F.solani）7株、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）23株和帚状弯孢聚壳（Eutypella scoparia）2株。致病性测定结果表明,尖孢镰刀菌代表性菌株和茄腐镰刀菌代表性菌株均可侵染山豆根引起典型的根腐病症状,且茄腐镰刀菌致病性明显强于尖孢镰刀菌。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果,确认分离得到的病原菌分别为尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌。【结论】贵州山豆根根腐病主要由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌复合侵染引起。     

解淀粉芽胞杆菌B9601-Y2对大白菜软腐病防治效果研究

为了明确解淀粉芽胞杆菌B9601-Y2(Y2)对大白菜软腐病的防治效果,本研究通过平板对峙和离体生防试验评估了B9601-Y2对软腐病的生防潜力,同时采用绿色荧光蛋白标记菌株Y2-gfp,测定其在大白菜植株内的定殖能力,在温室内研究了B9601-Y2对大白菜软腐病的防治和增产效果。结果表明,B9601-Y2在LB平板和离体植物组织上均能有效地抑制软腐病原菌的生长;淋灌Y2-gfp发酵液后,标记菌在大白菜根际、根、茎、叶等组织内的种群数量呈现出"先上升后下降最后趋于平稳"的趋势,最终稳定在约10~3cfu/g组织;温室防效试验结果表明,移栽生防苗后淋灌Y2菌悬液防治效果最佳,为62.23%,仅移栽生防苗与移栽普通苗后淋灌Y2菌悬液防效分别为28.87%与49.48%,大白菜产量分别增加了146.58%、47.52%及109.37%。研究结果表明解淀粉芽胞杆菌B9601-Y2能够有效防控大白菜软腐病。