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1.
试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞(PK15)的转染效率,为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象,用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,进而比较3种方法的转染效果。结果显示,转染PK15细胞后,电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体(P<0.01),但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著(P>0.05);EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好,脂质体方法较差,与细胞转染效率基本一致;CCK-8结果显示,电穿孔转染后细胞存活率最低,极显著低于对照组(P<0.01),脂质体方法显著低于对照组(P<0.05),慢病毒方法与对照组间差异不显著(P>0.05)。综合考虑转染效率及细胞活性,本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞,为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。 相似文献
2.
草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP7可以成功的表达,为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。 相似文献
3.
为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。 相似文献
4.
研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能,重点考察其粒度,基因转染效率与细胞毒性,探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪(DSL)、透射电镜(TEM)观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径,Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160~210 nm的纳米复合物,适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI,PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞,应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,有望成为基因转移的有效载体. 相似文献
5.
脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。 相似文献
6.
为了探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用,采用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),用脂质体介导瞬时转染BERP35T 2肺癌细胞系,并采用Northernblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。结果表明,根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对2个不同靶序列的siRNAs;Northernblot杂交显示,在转染siRNA的BERP35T 2细胞中,不管是内源性的还是外源性的,Smad7mRNA的表达丰度均明显下降。说明Smad7基因编码区中542563bp及701722bp2个区域均是siRNA作用的有效靶序列,本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制Smad7基因的表达。 相似文献
7.
选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl-2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96h,用流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF-1的含量。结果发现,转染Bcl-2重组质粒组的Bcl-2蛋白表达量和IGF-1分泌量均多于其他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF-1分泌量减少,而F4的IGF-1分泌量基本不变。结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl-2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF-1的作用;鸡卵泡颗粒细胞IGF-1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响。 相似文献
8.
将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。 相似文献
9.
乙酰胆碱酯酶(AChE;EC 3.1.1.7)是神经传导中调节神经递质乙酰胆碱水平的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标。目前关于朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的真核表达还未见报道。本研究拟构建朱砂叶螨AChE的真核表达载体,进行在293T细胞中表达条件摸索。将朱砂叶螨野生型ace完整读框和去掉3’疏水区的ace基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,经PCR和双酶切鉴定及测序验证后,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/ace。采用GFP报告基因确定在293T细胞中表达条件摸索,结果表明293T细胞的最适转染时间为48h和LipofectamineTM2000转染试剂的最适加样量为20μL。本试验成功构建了朱砂叶螨AChE的真核表达载体,确定了在293T细胞中的表达条件,为后续筛选新型选择性AChE抑制剂奠定了基础。 相似文献
10.
试验旨在优化Smad泛素化调节因子2(Smurf2) siRNA最佳转染条件,筛选最佳siRNA干扰片段,进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默,为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质,将Smurf2 siRNA转染入RTECs;通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件,转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响;同时,用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时,转染效率最高,为70%~80%;Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显;与正常组相比,转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件,其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。 相似文献