紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

生物活性物质角鲨烯的资源及其应用研究进展

通过查阅大量的文献资料，综述了生物活性物质角鲨烯的来源和应用。角鲨烯广泛存在于动植物体内，在动物中以深海鱼类，特别是鲨鱼的肝脏中含量最为丰富，在鲨鱼肝油中的最高含量可达69％；而在植物中则以苋属植物的种子油中含量最高，达5％～8％，在橄榄油中检测到的最高含量为1．16％。角鲨烯有较强的生物活性，被广泛应用在医疗保健品和化妆品等方面。角鲨烯易于氧化，贮存时需要加入适当的抗氧剂。     

金合欢基溴合成角鲨烯反应及异构体形成机理的研究

通过自制高效偶联试剂三三苯基膦氯化亚钴和自制金合欢基溴的还原偶联反应，成功地合成了角鲨烯。初步探索了主要反应条件如反应时间等对偶联反应中产物角鲨烯得率的影响。结果表明，在常温、偶联试剂过量10％、反应4h及充分搅拌的条件下，角鲨烯得率45．6％。用GC和GC-MS分析了合成产物角鲨烯，探讨了角鲨烯6个异构体的形成机理和可能的化学结构以及在GC图谱中的出峰顺序。另外，还探讨了合成三三苯基膦氯化亚钴中硼氢化钠滴加速度和搅拌速率对反应的影响。     

外源鲨烯和茉莉酸甲酯对印楝素生物合成代谢网络的影响

基于广泛靶向代谢组技术,以印楝愈伤组织为材料,研究了外源鲨烯和茉莉酸甲酯(MeJ)处理对印楝素生物合成代谢网络的影响.通过饲喂印楝愈伤组织鲨烯和茉莉酸甲酯,结合超高效液相色谱和质谱分析手段,对饲喂处理后的印楝愈伤组织代谢物进行定性定量分析.结果 表明,MeJ和鲨烯显著影响印楝愈伤组织的代谢活动,MeJ处理后共检132种差异代谢物,包括52种初生代谢物和80种次生代谢物.MeJ调控有机酸、脂质、氨基酸以及黄酮类和酚类物质的代谢,抑制印楝素B、诺米林和葫芦素E的合成.鲨烯处理检出137种差异代谢物,32种代谢物表达上调.MeJ和鲨烯均显著促进印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成,抑制印楝素B和D的合成.初步阐明了MeJ和鲨烯影响印楝素A合成的机制,即二者通过调控初级代谢途径,影响印楝素合成前体的供给;通过抑制固醇类物质的次生代谢,促使更多的前体进入印楝索A合成的代谢流,进而调控印楝素的生物合成.     

不同品种及成熟度橄榄油中角鲨烯的检测分析

以云南引种的13个不同品种及8个不同成熟度的油橄榄果为原料,通过索氏抽提法提取其粗脂肪,再以气-质联用法定性定量分析该粗脂肪中角鲨烯的含量差异.结果表明,13个不同品种橄榄油中,城固32角鲨烯含量最高,莱星含量最低;不同成熟度的3个品种(城固32、佛奥和阿斯),橄榄油随成熟度提高,角鲨烯含量越高.     

Detection and Analysis of Squalene in Oil from Olive Fruits of Different Varieties and of Different Degrees of Maturity

[Objective] This study aimed to identify the difference in squalene content among different olive varieties and the law of squalene content change in the same olive variety of different degrees of maturity, with the objective to provide technical support for the harvest and processing of olive fruits. [Method] Taking 13 introduced olive varieties including three varieties of eight different grades of maturity, fat acid w3s first extracted by Soxhlet extraction and then squalene was quantitatively and qualitatively analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method. [Result] The results showed that squalene content was the highest in CG-32, and the lowest in Leccino among the 13 olive varieties. And squalene content increased with the degree of maturity in the three olive varieties including CG-32, Frantoio and Ascolana Tenera. [Conclusion] A more simple and rapid method for the determina- tion of squatene content was established.     

铁皮石斛鲨烯合酶基因的克隆及其组织表达模式分析

【目的】克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因(DoSS),并对其进行生物信息学与组织表达模式分析,为研究其生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR和RACE技术,获得DoSS基因全长序列;利用生物信息学软件预测DoSS蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行DoSS蛋白氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助qPCR检测DoSS基因的组织表达模式。【结果】成功克隆获得铁皮石斛鲨烯合酶基因,命名为DoSS(GenBank注册号JX272631),其cDNA全长1 735bp,编码一条由410个氨基酸组成的多肽,分子质量46.99ku,等电点7.13;DoSS蛋白含有鲨烯/八氢番茄红素合成酶保守结构域(44-315位氨基酸);DoSS与其他多种植物SS基因的编码蛋白同源性很高(61%~75%),与水稻、玉米等单子叶植物的亲缘关系较近;DoSS基因为组成型表达,在根中的表达量最大,为叶的12.41倍;茎次之,为叶的1.87倍。【结论】成功克隆得到1个鲨烯合酶基因(DoSS)全长cDNA;DoSS基因的(在根中高)表达特征暗示,其可能在铁皮石斛根的生长发育中发挥重要的调控功能。     

龙牙楤木SE基因克隆与植物表达载体构建

采用RT-PCR的方法,从龙牙木忽木中克隆到鲨烯环氧酶(SE)基因,该基因的cDNA全长为1 682 bp,含有1 644 bp的开放阅读框(ORF),编码547个氨基酸,将所得的序列提交GenBank数据库,登录号为GU354314.序列分析结果表明:龙牙楤木SE基因的氨基酸序列与人参、三七、绞股蓝的同源性>90%,...     

口服鲨烯对大鼠Leptin、体脂沉积和繁殖的影响

将22日龄Wistar雄鼠32只,分对照组(饲料中不含鲨烯)和试验组(每千克饲料中含鲨烯1 000mg),宰杀后测定血Leptin、血糖、胆固醇、甘油三酯和睾酮水平及体重脂肪指数和体重睾丸指数,同时,各组留6只与雌鼠交配,待观察产仔数.结果显示,对照组和试验组饲料消耗没有差异,但试验组大鼠体重、体重脂肪指数、血Leptin、血糖、胆固醇和甘油三酯水平显著比对照组低,而试验组大鼠的体重睾丸指数、血睾酮水平和产仔数显著比对照组高.提示口服鲨烯可防止正常鼠体重和体脂肪增加并可降低肥胖鼠体重脂肪指数及降低血Leptin、血糖、胆固醇和甘油三酯的水平;同时,鲨烯可促进睾丸生长发育和睾酮分泌,增加产仔数.     

刺五加鲨烯合酶基因2 cDNA的克隆与蛋白结构分析

采用RT-PCR和RACE法克隆了刺五加鲨烯合酶基因2(squalene synthase gene 2,SS2)cDNA的全长序列(GenBank登录号:JN714465)。该序列全长1 463bp,其中5’端非翻译区长10bp,3’端非翻译区长208bp,开放阅读框长1 245bp,编码414个氨基酸。该蛋白具有1个Trans_IPPS_HH保守区域、2个鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异性识别区域及2个跨膜区。氨基酸序列比对结果表明,该蛋白与五加科其它植物SS的一致性均大于90%,与刺五加SS1的一致性为91.79%。