重组蛋白包涵体的研究进展

在介绍包涵体形成原因、特性及利弊的基础上,重点阐述了包涵体的复性前准备、主要复性方法及提高复性效率的有效措施。     

O型口蹄疫病毒VP1基因原核表达及蛋白纯化

以O型FMDV重组质粒pMD18T-O-VP1为模板，利用PCR技术扩增得到O型FMDV-VP1基因片段，将此基因片段与原核表达载体pET32a连接构建重组表达载体pEq32a-O-VP1，经PCR和测序鉴定后，用WIG诱导归1基因的表达，收集不同诱导时间的菌液，进行SDS-PAGE电泳，摸索掌握最佳诱导时间，切取最佳诱导时间电泳胶片做Westem-blotting，分析检验表达产物与其抗血清的反应性。结果显示，分子量约为45ku的蛋白条带反应显著，能被口蹄疫阳性血清识别，表明FMDV-VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达，纯化复性的表达蛋白有望开发为诊断抗原和多肽疫苗。     

Expression and purification of re-constructed human CRP and observation of its internalization into HeLa cells

AIM: To construct prokaryotic expression vector for human C-reactive protein (CRP), to acquire the functional fusion protein purified from BL21(DE3) transformed with vector pET14b/EGFP-hCRP, and to observe the internalization of the fusion protein his-EGFP-CRP into tumor cell line HeLa. METHODS: CRP gene sequence was amplified with the vector p91023/CRP as template by PCR, and was inserted into vector pET14b/MCS-EGFP-(N)36 to construct prokaryotic expression vector. The E. coli cells BL21(DE3) transformed with the re-constructed vector pET14b/EGFP-hCRP was induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the expressed protein his-EGFP-CRP were purified with affinity chromatography method and refolded with gradient filtration. The HeLa cells were observed under the fluorescence microscopy after the addition of purified renature protein. RESULTS: The results of identification by PCR, digestion with restriction endonuclease and sequencing indicated the construction of vector pET14b/EGFP-hCRP was correct; the SDS-PAGE showed that the transformed E. coli cells could be induced to express the fusion protein his-EGFP-CRP and the purification of proteins were successful. We could found fluorescent signal around the cell membranes, in the cytoplasm and nuclei in the observation of the HeLa cells incubated with his-EGFP-CRP. CONCLUSION: The prokaryotic expression vector for human CRP linked with his and EGFP coding sequence is successfully constructed. The fusion protein his-EGFP-CRP is purified and refolded. The reconstructed protein expressed by prokaryotic cells adheres to the membrane of tumor cell HeLa and is internalized into the cytoplasm and nuclei of the cells.     

棘孢木霉几丁质酶基因的原核表达、复性、纯化以及酶学性质研究

为高效表达几丁质酶基因tachi1,研究Tachi1的酶学性质。采用PCR技术从棘孢木霉中克隆了几丁质酶基因tachi1并与pEHisTEV原核表达载体融合,转化大肠杆菌BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式高效表达的Tachi1。包涵体经洗涤、溶解、复性和纯化后获得了高纯度的Tachi1。复性后的Tachi1具有较高的几丁质酶活性,该几丁质酶反应的最适温度为50℃,最适pH5.5。几丁质酶在30～35℃下稳定,在pH3～7之间几丁质酶有较高活性。     

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。     

Preparation of Bioactive Recombinant Chicken Leptin Fusion Protein

将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSET A的Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ两位点之间，构建重组表达质粒pLep -SCAU2并转化大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素100 μg/mL 的LB培养基中培养至OD600大于0.6之后，经IPTG 0.05 mol/L诱导表达出分子量约为17.5 kD的含6×His标记的重组鸡Leptin，诱导4 h后表达量达最高，占总菌体蛋白的25％左右,且以包涵体形式存在。该重组鸡Leptin经50％Ni-NTA树脂纯化和透析复性折叠后分离出可溶性部分。对35日龄的矮脚黄鸡腹腔注射该可溶性重组鸡Leptin（2 mg/kg 体重）；注射后60 min内的采食量与对照组差异不显著 （P > 0.05），但在注射后80~120 min都显著低于对照组（P < 0.05）。Leptin处理公鸡的采食量在注射2 h后逐渐上升并在5.5 h时与对照组公鸡相同。但Leptin处理母鸡的采食量持续受到抑制，在注射后5.5 h时仍然显著低于对照组母鸡（P <0.01）。表明所表达的重组鸡Leptin能显著抑制鸡的采食量（母鸡比公鸡效果更为明显），证明所制备的重组鸡Leptin融合蛋白具有生物学活性。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

重组甘蔗ACC氧化酶cDNA原核表达的纯化复性研究

重组甘蔗ACC氧化酶基因在大肠杆菌中表达,其产物以不溶性包涵体存在。用N i2 -NTA亲和层析柱对其进行纯化,结果显示,在层析柱上直接复性及纯化的方法比在变性条件下N i2 -NTA纯化然后稀释透析进行复性的方法简捷,效果好,获得的目的蛋白质纯度大于98%,活性为132.58 nm o l C2H4/(m g.h)。     

不同类型表面活性剂对肌酸激酶活力影响研究

本文系统地研究了阴离子Ｃ１２Ｈ２５ＳＯ４Ｎａ（Ｃ１２Ｓ），Ｃ１２Ｈ２５（ＯＣ２Ｈ４）７ＳＯ４Ｎａ（Ｃ１２Ｅ７Ｓ）、阳离子Ｃ１２Ｈ２５Ｎ（ＣＨ３）３．Ｂｒ（Ｃ１２ＮＭｅ３）和非离子Ｃ８Ｈ１７．Ｃ６Ｈ４．（ＯＣ２Ｈ４）１０ＯＨ（ＴＸ－１００）表面活性剂对肌酸激酶（Ｃ．Ｋ．）活力的影响以及变性后的复性，结果表明，Ｃ１２Ｅ７Ｓ和Ｔｘ－１００对Ｃ．Ｋ．的活力破坏较小，Ｃ．Ｋ．经Ｃ１２Ｅ７Ｓ和ＴＸ－１００变性     

表面活性剂类型对超氧化物歧化酶活力的影响研究

本文研究了阴离子Ｃ１２Ｈ２５ＳＯ４Ｎａ（Ｃ１２Ｓ），Ｃ１２Ｈ２５（ＯＣ２Ｈ４）７ＳＯ４Ｎａ（Ｃ１２Ｅ７Ｓ），阳离子Ｃ１２Ｈ２５ＮＣ（ＣＨ３）３·Ｂｒ（Ｃ１２ＮＭｅ３）和非离子Ｃ８Ｈ１７Ｃ６Ｈ４（ＯＣ２Ｈ４）１０ＯＨ（Ｔｘ－１００）表面活性剂对超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力的影响以及变性后的复性。结果表明，Ｃ１２Ｅ７Ｓ和Ｔｘ－１００对ＳＯＤ的活力几乎无破坏，Ｃ１２Ｓ对ＳＯＤ只具有一定的破坏性，Ｃ１２ＮＭｅ３对ＳＯＤ具有较强的变性能力