水稻胚乳RNA定量RT-PCR分析中参照基因选择

以6个籼粳稻品种胚乳总RNA为研究材料,检测包括eEF-la、eIF-4a、UBC、GAPDH、UBQ-5、TBL和ACTl在内的7个常用管家基因的表达稳定性情况,通过geNorm软件分析选择最佳参照基因.结果表明:不同的品种间,eEF-la和ACT1的表达最为稳定,UBC的表达变化最为明显.当利用多基因作为内参基因时,使用两个最稳定表达的管家基因即可达到准确校正的目的.该结果为水稻等植物中基因表达分析时内参基因的选择提供了参考.  

免疫刺激后小鼠肝脏内参基因稳定性研究

实时定量PCR技术现已广泛应用于细胞或组织mRNA转录水平的检测和半定量。选择合适的内参基因可以消除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别,从而获得目标基因特异性表达的真正差异。本试验应用实时定量PCR技术,研究小鼠在经过免疫刺激后,B2M、ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和ARBP共6个内参基因在肝脏中的表达情况。结果表明,这6个内参基因表达存在差异。经过geNorm程序统计学分析,确定了ACTB、GAPDH两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究小鼠免疫刺激后肝脏目标基因的表达奠定基础。  

二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因，并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，RT-qPCR）技术，分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性，并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases，CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase，GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases，P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估，通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin；以α-tubulin为内参基因，二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系，而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因，RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。  

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择

【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan Drop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)的特异性引物序列,逆转录得到cDNA模板后,按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测,采用Ge Norm法对定量结果进行综合分析,最后根据内参基因稳定性值(M值)的大小筛选出最稳定的参考基因;M值越小,表明内参基因的稳定性越好,反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现,均无非特异扩增及引物二聚体,说明各内参基因特异性良好,qRT-PCR反应的专一性高;以Ct值为纵坐标,相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知,各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系;通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现,蛋白编码基因中,最稳定的为TBP,最不稳定的是GAPDH;miRNA候选内参中,最稳定的为U6,最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因TBP和U6,可作为猪睾丸组织基因表达研究中最佳内参基因候选者。  

杨属转基因植物PCR检测内标准基因的建立

为了建立适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内对照系统,利用目前genebank中已公布的杨属植物的叶绿体DNArbcL基因的保守区域,设计了两对PCR引物:rbcL-1引物和rbcL-2引物,分别成功地对五大派10种杨属植物进行了rbcL基因片段的扩增,第一次建立了适用于杨属植物转基因成分PCR检测的内标准基因对照系统。其中rbcL-1引物适用的退火范围很广,在52.0～68.0℃之间均能得到特异性很强的扩增产物,这有利于其他检测项目(如35S启动子、NOS终止子、标记基因及目标基因)的引物随意搭配进行多重PCR检测,从而提高检测效率、缩短检测周期。  

甘菊内参基因ClTUA的克隆与表达分析

根据前期工作已获得的甘菊α-tubulin基因EST序列,使用RACE技术获得了该基因的全长序列,命名为ClTUA。生物信息学分析表明,ClTUA基因全长cDNA序列为1580bp,编码432个氨基酸残基。利用MEGA4.0软件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现,其为植物中Ⅰ类α-tubulin基因。RT-PCR分析发现:ClTUA基因不仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达,而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达;而作为对照的两个内参基因,ClActin和26SrRNA基因在不同非生物胁迫下表达稳定,但在不同生长发育阶段的样本中表达强度不同。这一结果表明,ClTUA基因的表达稳定性优于ClActin和甘菊26SrRNA基因,可以作为内参基因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。  

中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织GAPDH基因实时荧光定量PCR方法的建立

【目的】建立GAPDH内参基因实时荧光定量PCR方法,为进一步研究中国美利奴羊(新疆型)相关基因的定量表达奠定基础。【方法】采用中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织为试材,根据Genebank中绵羊GAPDH基因序列,设计并合成一对引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其熔解曲线分析。【结果】以cDNA为模板建立的标准曲线循环阈值(Ct)与标准cDNA模板在一定浓度范围内呈良好的线性关系,GAPDH基因标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct=一3.679 51g/X+35.648,相关系数R=0.999 8;试验重复性好,批内和批间变异系数(CV%)分别为0.22%～3.45%和1.30%～4.89%。【结论】所建立的方法具有快速、线性范围广、重复性强等特点,GAPDH可作为内参基因用于绵羊相关基因的定量表达研究。  

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。  

Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Laodelphax striatellus

The normalization of quantitative real-time PCR （qPCR） is important to obtain accurate gene expression data, and the most common method for qPCR normalization is to use reference genes. However, reference genes can be regulated under different conditions, qPCR has recently been used for gene expression study in Laodelphax striatellus, but there is no study on validation of the reference genes. In this study, five new housekeeping genes （LstrTUB1, LstrTUB2, LstrTUB3, LstrARF and LstrRPL9） in L. striatellus were cloned and deposited in the GenBank with accession numbers of JF728809, JF728810, JF728811, JF728807 and JF728806, respectively. Furthermore, mRNA expressions of the five genes and β-actin were measured by qPCR with insect samples of different instar at nymph stage, and the expression stabilities were determined by the software geNorm and NormFinder. As a result, ARF and RPL9 were consistently more stable than β-actin, while three TUB genes were less stable than β-actin. To determine the optimal number of reference genes used in qPCR, a pairwise variations analysis by geNorm indicated that two references ARF and RPL9 were required to obtain the accurate quantification. These results were fiarther confirmed by the validation qPCR experiment with chitinase gene as the target gene, in which the standard error of the mRNA quantification by using binary reference ARF-RPL9 was much lower than those by ARF, RPL9 or β-actin alone. Taken together, our study suggested that the combination of ARF-RPL9 could replace β-actin as the reference genes for qPCR in L. striatellus.  

干旱-溃疡病菌胁迫下北京杨水通道蛋白基因表达特征分析

为揭示杨树溃疡病发生进程中的水分生理学机制,本研究以1年生北京杨为材料,对干旱-溃疡病菌胁迫下的杨树管家基因表达稳定性、与植物水分运输密切相关的杨树水通道蛋白基因家族的表达特征进行了实时定量PCR(RT-qPCR)分析.结果表明:12个管家基因的表达稳定性不同,TUB、UBQ、EIF4β-L、CYP、EF1α2表达稳定性最高,ACT2和ACT11稳定性最差;配对分析显示TUB、EIF4β-L和UBQ为干旱胁迫-溃疡病菌胁迫下基因表达检测的最优内参基因组合;干旱及溃疡病菌胁迫下,水通道蛋白基因的表达模式并不相同,说明这两种胁迫对杨树水分代谢具有不同的影响;干旱-溃疡病菌双重作用下,PIP1;1、PIP1;3、PIP1;5、PIP2;4、PIP2;7等5个基因的表达显著高于干旱、溃疡病菌两种胁迫的单独作用,揭示这两种环境胁迫对水通道蛋白基因表达具有一定的协同作用.