真核表达NDV F基因重组质粒的构建及其在CEF细胞中的转染

通过PCR方法自含NDVZF基因的克隆质粒中扩增NDVF基因 ,将其与真核表达载体pcDNA3..1/V5_His_TOPO重组。经核酸内切酶酶切 ,阳性克隆鉴定准确无误 ,核酸序列测定结果与原始基因比较 ,同源性大于 99% ,启始密码和终止密码未出现变异 ,将该重组质粒命名为pcDNANDVZF。将pcDNANDVZF在脂质体作用下转染CEF细胞 ,用间接免疫荧光试验检测 ,结果证明pcDNANDVZF可在CEF细胞中大量表达F蛋白。     

真核表达载体构建表达ＰＲＶ闽Ａ株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒

根据伪狂犬病病毒闽Ａ株gE基因表位抗原编码区的序列与身份种真核表达载体pPICZaA、pAcGP67A序列与特性分别设计了两对ＰＣＲ引物。通过ＰＣＲ方法扩增到了两端具有不同酶切位点的gE基因表位抗原编码片段。将这２个片段分别克隆到pPICZaA与pAcGP67A载体，转化大肠杆菌ＴＯＰ１０菌档及ＸＬ１－Ｂlue菌株，获得了含伪狂犬病病毒闽Ａ株gE基因表位抗原编码区的重组质粒pICZaA-FS与pAcGP67A-FS。序测定结果显示两个重组质粒中插入片段的大小与方向均正确。     

Rapid Screening for Aluminum Tolerance in Cereals by Use of the Chlorophyll Fluorescence Test

The effects of aluminum on the photosynthetic apparatus were examined in cereals grown in nutrient solutions (pH 4.5) at two Al levels (0 and 148 μM). The chlorophyll fluorescence kinetics results confirmed that the soft wheat ‘BHG’ cultivar has the potential for growth on acid soils while triticale cultivars ‘Niovi’ and ‘Dada’ appeared to be relatively tolerant. The percentage decrease in F_v/F_m of the less tolerant cultivars after Al-treatment indicated a decrease in the efficiency of the primary photochemistry of PS II, while the decrease in the ratio F_V/F_osuggested that exposure of the cultivars ‘Dio’ and ‘Appulo E’ to aluminum caused injury to the thylakoid structure. The percentage fluctuations of the ratio F_v/F_mwere shown to correlate very closely with the assessment of injury as evaluated by the relative top fresh weight. Measurements of chlorophyll fluorescence in vivo could be used to monitor injury caused by “Al-stress”, and thus they may serve as a rapid screening test for Al tolerance.     

动物病毒性传染病的基本特征

动物病毒病几乎占传染病中的80％，经长期研究和查阅大量文献资料后，发现病毒性传染病具有许多独特的特征，了解掌握这些特征对病毒病的诊断，预防，治疗具有重要的指导作用。     

绵羊慢病毒自然感染绵羊的硬化性淋巴细胞性乳腺炎

７头来自新疆南部某绵羊慢病毒（ＯｖＬＶ）感染的羊场的绵羊用于本研究。用琼脂凝胶免疫扩散检查绵羊血清中对绵羊进行性肺炎（ＯＰＰ）病毒（ＯＰＰＶ）的抗体，结果表明有６例呈阳性，１例阴性，抗体效价在３年中呈下降趋势。４例血清学阳性边菜羊和１例阴性和田羊有不同程度的硬化性（纤维性）淋巴细胞性乳腺炎，小叶内有不等的淋巴细胞浸润，导管周围无淋巴滤泡形成，小叶间大量纤维组织增生。７例的肺、脑、关节、血管均无ＯｖＬＶ性特异性病变。从血清学阳性羊的外周血白细胞中未分离到ＯｖＬＶ。     

Transmission of the agent causing a melon yellowing disease by the greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum in southeast Spain

The agent causing a yellowing disease of melon (Cucumis melo), which results in severe losses in crops under plastic on the coastal plains of southeast Spain, was shown to be transmitted in a semipersistent manner by the greenhouse whitefly (Trialeurodes vaporariorum Westwood). The agent was transmitted by grafting, but not by mechanical inoculation or through seeds. The agent was acquired in the minimum period tested (2 h) and could infect plants in an infection feeding interval of 6 h. Capsella bursa-pastoris, Cucumis melo, C. sativus, Cucurbita moschata, Cichorium endivia, Lactuca sativa andTaraxacum officinale were found susceptible.Results suggest that the yellowing disease affecting melon crops in the southeast of Spain is due to a pathogen similar to beet pseudo yellows virus, but this has to be confirmed by serology.     

Infection process of Rhizoctonia solani on Solanum tuberosum and effects of granular nematicides

The infection process ofRhizoctonia solani AG-3 was studied on potato sprouts, cv. Bintje, in growth chamber trials at 15 °C. Initially hyphae ofR. solani grew predominantly in the longitudinal direction of the sprouts (runner hyphae). They tended to follow the junctions between epidermis cells as was observed by SEM. The hyphae formed side-branches mainly half-way of the subterranean parts of the sprouts. They branched several times with short swollen cells to form infection cushions. Lesions developed only underneath the infection cushions and were first observed five days after inoculation. The necrotic area was proportional to the area covered with infection cushions on the sprouts. Depth of the lesions could extend up to the vascular bundle. Sprouts were colonized only in healthy tissue in the epidermal layer underneath the infection cushion and in necrotic tissue. A few days after appearance of the lesions,R. solani formed brown, uninfective mycelium on and in the circumference of these lesions.Aldicarb did not influence any part of the infection process. Ethoprophos delayed the emergence of sprouts, but increased the number of sprouts per tuber. As soon as sprouts had emerged, growth was considerably promoted by ethoprophos. Ethoprophos delayed the appearance of lesions and reduced their size. Oxamyl showed the same effects to a smaller extent.As the size of lesions appears to be proportional to the size of the infection cushions, any agents that change the size of the infection cushions, such as pesticides or antagonists, may alter the severity of the disease.Samenvatting Het infectieproces vanRhizoctonia solani AG-3 werd bestudeerd op aardappelspruiten, cv. Bintje, in een klimaatcel bij 15C. Aanvankelijk groeide de schimmel met runnerhyfen voornamelijk in de lengterichting van de spruit. Via SEM kon waargenomen worden, dat de hyfen hierbij vooral over de begrenzingen van de epidermiscellen groeiden. Het mycelium vormde veel zijvertakkingen, bestaande uit iets gezwollen korte cellen, welke voornamelijk halverwege op het ondergrondse deel van de spruit gevormd werden. Een dichte massa van deze cellen vormde een infectiekussentje. Lesies, welke vanaf vijf dagen na inoculatie werden waargenomen, bevonden zich slechts onder spruitoppervlak bezet met infectiekussentjes. De lesiegrootte was recht evenredig met het spruitoppervlak dat bezet was met infectiekussentjes. De diepte van de lesies reikte tot aan de vaatbundels. De spruit werd alleen door de schimmel gekoloniseerd in gezond epidermisweefsel onder het infectiekussentje en in necrotisch weefsel. Enkele dagen na verschijning van lesies vormde R.solani bruin, niet infectieus, mycelium op en rondom de lesies.Aldicarb had geen effect op het infectieproces. Ethoprophos vertraagde de opkomst en verhoogde het aantal tot ontwikkeling gekomen spruiten per knol in gestoomd zand. Direct na opkomst had ethoprophos echter een sterk groeistimulerend effect. Ethoprophos vertraagde de lesievorming en reduceerde de lesiegrootte, vergeleken met onbehandelde planten. Oxamyl vertoonde deze effecten in geringere mate.Daar de lesiegrootte direct gecorreleerd blijkt met de grootte van het infectiekussentje, mag verwacht worden dat elke beïnvloeding van de ontwikkeling van het mycelium van R.solani, bijvoorbeeld door pesticiden of antagonisten, een verandering van de lesiegrootte ten gevolge heeft.     

Pathogenic mechanisms of caprine arthritis-encephalitis virus

Goats infected with caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) show chronic arthritis and cachexia, which are progressive in nature. The immunopathogenic mechanisms responsible for these progressive clinical symptoms have not been fully elucidated. Various haematological and immunological parameters were evaluated in experimentally-infected goats showing typical signs of CAEV-induced disease. Infected goats showed recurrent lymphocytosis that may be due to constant presentation of antigen by infected cells of a monocyte/macrophage lineage. The serum alkaline phosphatase and -glutamyl transferase concentrations were elevated in infected goats, a characteristic of hepatic and bone disorders. All other serum chemistry parameters were similar between infected and control goats. Importantly, the serum tumour necrosis factor- (TNF-) levels were higher in infected goats. The cachexia seen in infected goats may be at least partly due to altered metabolism as a result of prolonged elevation of serum TNF- levels. Depressed natural killer cell activity was observed in infected goats and may contribute towards the establishment of a persistent infection with CAEV.Abbreviations AIDS acquired immunodeficiency syndrome - CAEV caprine arthritis-encephalitis virus - GGT -glutamyl transferase - HBSS Hanks' balanced salt solution - HIV human immunodeficiency virus - NK natural killer - PBMC peripheral blood mononuclear cells - PCR polymerase chain reaction - SAP serum alkaline phosphatase - TNF tumour necrosis factor     

Comparison of the effects of salicylic acid and ethephon with virus-induced hypersensitivity and acquired resistance in tobacco

The induction of a hypersensitive reaction in Samsun NN tobacco by tobacco mosaic virus (TMV) at 20°C leads to the development of both localized and systemic acquired resistance, and is associated with the appearance of pathogenesis-related proteins (PR's) and large increases in peroxidase activity and ethylene production. Salicylic acid (SA) induced a similar resistance in treated plant parts and occasionally also in untreated upper leaves of plants of which three lower leaves had been injected. SA also induced the same four PR's, but these were confined to the treated leaves. Thus, the connection between the presence of PR's and the reduction of TMV multiplication and spread may not be direct.In contrast to TMV, SA did not stimulate ethylene production and hardly increased peroxidase activity. Induction of acquired resistance and PR's by SA developed equally well at 20°C and at 32°C. However, pricking leaves with needles moistened with the ethylene-releasing compound ethephon mimicked TMV infection in inducing acquired resistance and PR's in both treated and untreated leaves at 20°C, but not at 32°C. Ethephon increased peroxidase activity at both temperatures, but only at 20°C dit it induce changes in both the anodic and the cathodic isoenzymes that were similar to those induced as a result of TMV infection. SA induced PR's and reduced TMV multiplication in Samsun tobacco, and inhibited virus spread in Samsun NN at 32°C.These observation indicate that neither the induction of PR's, nor the development of acquired resistance is temperature-sensitive. On the other hand, the effects of ethephon are temperature-sensitive in the same way as the hypersensitive response to TMV. It can thus be hypothesized that ethylene, produced naturally during the hypersensitive reaction of tobacco to TMV, leads to the temperature-sensitive synthesis or release of a presumably benzoic acid-type compound that functions as the natural inducer of PR's and acquired resistance. Although vanillic acid has been shown to accumulate in hypersensitively reacting tobacco leaves, it produced none of the effects of SA, and thus cannot be the natural inducer.Samenvatting Inductie van een overgevoeligheidsreactie in Samsun NN-tabak door tabaksmozaïekvirus (TMV) bij 20°C leidt tot de ontwikkeling van een verworven resistentie die zowel lokaal als systemisch werkzaam is, en gaat samen met het verschijnen van pathogenesis-related proteins (PR's) en sterke toename in de activitieit van peroxidase en de produktie van ethyleen. Salicylzuur (SA) induceerde een vergelijkbare resistentie in behandelde plantedelen en af en toe ook in niet behandelde bovenbladeren van planten waarvan drie onderbladeren waren ingespoten. SA induceerde ook dezelfde vier PR's, maar deze waren beperkt tot de behandelde bladeren. Er bestaat dus geen directe samenhang tussen de aanwezigheid van PR's en de remming van de vermeerdering en uitbreiding van TMV in de plant.In tegenstelling tot TMV stimuleerde SA de ethyleenproduktie niet en verhoogde het de peroxidaseactiviteit nauwelijks. Inductie van verworven resistentie en PR's door SA trad even goed op bij 32°C als bij 20°C. Net als infectie met TMV leidde aanprikken van bladeren met naalden die gedoopt waren in een oplossing van ethefon — waaruit in het blad ethyleen vrijkomt — echter tot inductie van verworven resistentie en PR's in zowel behandelde als onbehandelde bladeren bij 20°C, maar niet bij 32°C. Ethefon verhoogde de peroxidaseactiviteit bij beide temperaturen, maar alleen bij 20°C induceerde het veranderingen in zowel de anodische als de kathodische isoënzymen die vergelijkbaar waren met die welke geïnduceerd werden als gevolg van infectie met TMV. SA induceerde PR's en verminderde de vermenigvuldiging van TMV in Samsun tabak, en remde de uitbreiding van het virus in Samsun NN bij 32°C.Deze waarnemingen tonen dat noch de inductie van PR's, noch de ontwikkeling van verworven resistentie een temperatuurgevoelig proces is. Daarentegen zijn de effecten van ethefon op dezelfde wijze temperatuurgevoelig als de overgevoeligheidsreactie op TMV. Men kan daarom veronderstellen dat ethyleen, dat op natuurlijke wijze geproduceerd wordt tijdens de overgevoeligheidsreactie van tabak op TMV, aanleiding geeft tot een temperatuurgevoelig proces, namelijk de synthese of het vrijkomen van een verbinding, vermoedelijk een benzoëzuurderivaat, dat fungeert als de natuurlijke inductor van PR's en verworven resistentie. Hoewel is aangetoond dat vanillinezuur zich ophoopt in overgevoelig reagerende tabaksbladeren, veroorzaakte deze verbinding geen enkel van de effecten van SA. Vanillinezuur kan dus niet de natuurlijke inductor zijn.     

Detection of squash mosaic virus in seeds of melon (Cucumis melo) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Squash mosaic virus (SqMV, comovirus) is seed-transmitted in severalCucurbitaceae. Therefore, the use of virus-free seed is important to prevent establishment of this virus in the Netherlands and to avoid spread to other countries.This study was undertaken to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of SqMV in melon seeds. An antiserum was produced to a serotype 1 isolate from melon. Two ELISA variants were investigated viz. an ELISA variant with simultaneous incubation of sample and enzyme conjugate (ELISA 1) and an ELISA variant with successive incubation of sample and enzyme conjugate (ELISA 2). The sensitivity of ELISA was tested by mixing fluor of ground infected and non-infected seeds in different proportions. SqMV was detected by both ELISA variants at dilutions of 1 160 (1 part of infected flour mixed with 159 parts of non-infected flour) or higher after a substrate incubation period of 4 h. However, ELISA 1 gave relatively higher absorbance values than ELISA 2 for nearly all dilutions. Since ELISA 1 is also faster than ELISA 2, ELISA 1 is advised for routine testing. In these test, using subsamples of 100 melon seeds SqMV is detected reliably. ELISA 1 is now used in the Netherlands for routine-indexing of melon seed lots for SqMV.Samenvatting Het pompoenemozaïekvirus gaat over met het zaad van verscheideneCucurbitaceae. Het gebruik van virusvrij zaad is belangrijk om te voorkomen dat het virus zijn intrede doet in Nederland en zich naar andere landen verspreidt.Een antiserum werd geproduceerd tegen een serotype 1 isolaat van meloen. Met behulp van dit antiserum werd een ELISA ontwikkeld om pompoenemozaïekvirus in zaden van meloen aan te tonen. Twee varianten van ELISA werden vergeleken, namelijk een variant waarbij monster en enzymconjugaat gelijktijdig geïncubeerd werden (ELISA 1) en een variant waarbij monster en enzymconjugaat na elkaar geïncubeerd werden (ELISA 2). De gevoeligheid van de ELISA varianten werd uitgetoetst door meel van zieke zaden in verschillende verhoudingen te mengen met meel van gezonde zaden. Het pompoenemozaïekvirus werd met beide ELISA varianten aangetoond in verdunningen van 1 160 (1 deel meel van zieke zaden gemengd met 159 delen meel van gezonde zaden) of hoger na 4 uur incubatie met substraat. ELISA 1 gaf doorgaans hogere extinctiewaarden dan ELISA 2 voor bijna alle verdunningen. Omdat ELISA 1 ook nog sneller is dan ELISA 2, wordt ELISA 1 aanbevolen voor routinematig gebruik. Wanneer voor routinematig gebruik 100 meloenezaden per submonster getoetst worden, kan het pompoenemozaïek virus betrouwbaar worden aangetoond. In Nederland worden momenteel per zaadpartij 20 submonsters van 100 zaden getoetst.