烟粉虱不同地理种群的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育

 烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的重要害虫并具有多种生物型。本文利用mtDNA COI基因片段对国内外12个地理种群烟粉虱的生物型进行了鉴定并对其来源进行了分析。序列比较和系统发育分析结果表明，采自北京海淀、河南郑州、山东枣庄、江苏南京、上海闵行、海南海口等地的烟粉虱与来自美国California州、Texas州、Arizona州以及以色列的B型烟粉虱的同源性达到99.8%～100%，由此可见目前在中国广大地区暴发成灾的烟粉虱生物型为B型；而采自云南省昆明地区一品红寄主植物上的烟粉虱与来自摩洛哥和西班牙的Q型烟粉虱具有极高的同源性，该烟粉虱生物型为Q型，这也是首次报道Q型烟粉虱入侵中国。  

狼亚种分化的RAPD分子证据

对来自我国东北、内蒙、甘肃、新疆等１０个地区的２１只狼（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ）应用ＲＡＰＤ方法进行亚种分化研究。筛选出２５个随机引物。通过对ＲＡＰＤ产生的谱带进行比较。找出共享片段，计算共享度和遗传距离。并进行聚类分析，做出聚类图，确定亲缘关系和分类地位。研究结果表明：（１）中国南北方狼有分化。在ＤＮＡ序列上存在着明显差异；（２）把所研究地区的狼划分为５个亚种，即：云贵群体（云南群体和贵州群体）和东南群体（福建群体、浙江群体和广东群体）亚种；东北群体、河北群体亚种；甘肃群体亚种；内蒙群体亚种；新疆群体亚种。  

班皮桉及其近邻树种CCR基因分子变异分析

选取伞房属班皮桉及其近邻树种共5部类16个样本提取基因组DNA,用2对引物进行PCR扩增,采用凝胶直接纯化,改进测序反应后测序.以Eucalyptus gunniiCCR作对照,通过ClustalW进行比对分析序列变异和MEGA 3进行系统进化分析.结果显示:在所得到的伞房属16个样本CCR序列中,A,C,G和T 4种核苷酸所占比例分别为24.92%,23.18%,23.22%和28.67%,A T含量明显高于G C.共发现292个变异位点,占分析位点总数的9.71%,变异除118个转换和97个颠换外,有93个位点的插入/缺失,其中简约信息位点185个,占63.36%.部分变异位点重叠.转换与颠换比值为1.22∶1.00.CCR系统发育树显示:E.gunnii是一个单独分枝,5部类亲缘可以分辨开来,Rufaria尤其明显.Rufaria最早产生分歧,其次是Ochraria和Cadagaria,Blakearia分歧属最迟进化.  

鳗鲡病原菌16SrRNA基因序列测定及系统进化分析

对从福建省不同鳗鲡养殖场发病鳗鲡肝脏中分离并经感染证实的35株致病菌的16S rRNA基因进行序列测定和系统进化分析.用CTAB法提取各菌株DNA,以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,用限制性片段长度多态性分析、16S rDNA序列分析和系统进化分析对其进行分子鉴定,构建系统进化树.结果表明:35株致病菌分别属于γ-变形菌纲和厚壁菌门2大类群的6个属和1个科,主要种类是气单胞菌属的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、简氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌等,占63%;其次是芽孢杆菌属细菌;少量为鲁氏耶尔森菌、弗氏柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌属、假交替单胞菌属细菌和肠杆菌科细菌.  

中国狼的种内系统发育关系与亚种分化

通过对来自5个地区、11个亚地区的43个中国狼(Canis lupus chanco)样品的mtDNA分析，得到了14个单倍类型。应用Mega2．1计算机软件包构建了NJ树。系统树的拓扑图显示，中国狼的母系群体来源于两个世系。且世系1要比世系2古老。此外，无论是在亚地区还是在地区的群体问。都存在明显的基因交流，使得地区间和地区内群体的遗传分化不明显。但是，结合序列分析、拓扑结构图和遗传距离分析认为，青藏和西南群体与我国其它地区群体具有等同的分类地位。  

猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析

利用RT-PCR技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析,从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒(JEV)M基因和E基因具有高度同源性的预期产物。在3日龄乳鼠脑内接种种猪精液上清,10 d左右即出现典型神经症状,并且病死鼠脑组织RT-PCR结果均为阳性。用病死鼠脑组织研磨上清接种BHK-21细胞,感染60 h后用JEV单抗进行间接免疫荧光鉴定均为阳性,这表明分离毒株均为JEV流行毒株,分别命名为BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3。对新分离毒株进行体外细胞培养,BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3连续传代3次后病毒量均获得明显增加,最高分别可达104.5±0.1TCID50/mL和104.2±0.2TCID50/mL。用生物学软件MEGA 4.0分别构建JEV基因的系统进化树,发现BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3处于同一进化分支,均属于基因Ⅲ型。  

海洋细菌B177的鉴定及活性物质研究

运用卤虫和玉米纹枯病菌为筛选靶标,从中国南海海泥的94株细菌中分离筛选到1株具有杀虫、抗菌活性的海洋细菌B177菌株。卤虫和玉米纹枯病菌筛选模型测定结果表明,当PSA为发酵液时,LD50值最低,为1.3μg.mL-1;当滤纸片加20μL(5mg.mL-1浓度)发酵粗提取物溶液时,抗玉米纹枯病菌抑菌圈直径可达26mm。对B177的形态特征、培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列进行了系统的研究,鉴定其为Micrococcus yunnanensis,其16S rDNA GenBank登录号为HQ439904。对其活性物质进行初步分离纯化研究。  

番木瓜环斑病毒海南分离物全基因组结构分析

从感病的海南番木瓜叶片中提取总RNA,经RT-PCR和RACE方法分段扩增番木瓜环斑病毒(PRSV)全基因组序列.序列拼接结果显示,PRSV中国海南分离株(HaiNan-P)基因组除3'-末端polyA尾巴外,由10323个核苷酸组成,编码3343个氨基酸.同源性分析表明,HaiNan-P编码的氨基酸序列与GenBank中公布的11株PRSV同源性为89.8%～93.2%,略高于全长核苷酸的82.3%～89.1%.P1蛋白编码区同源性较低,仅为65.4%～80.1%,而HC-Pro、CI及CP同源性相对较高.运用MEGA 3.1软件、NJ法绘制系统进化树,分析结果显示,PRSV分离株类群分化与地理分布有一定的相关性.  

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克隆、测序；用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树，分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系；以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性；构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒，并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性；应用建立的RT-PCR方法调查249份2012—2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况，随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板，应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带，与预期目的片段大小一致，扩增产物经克隆后测序，将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对，比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%，证明所扩增的序列属于PDCoV；②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树，结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支，而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近，同源性高达99.1%；与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远；③本试验建立的RT-PCR方法特异性强，仅能扩增出PDCoV，而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象；④所建立的RT-PCR方法灵敏度高，将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度，结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL；⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本，结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249），母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%），最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法；应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况，结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒；研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。  

厌氧除磷菌的富集及功能菌组成研究

[目的]富集厌氧除磷菌,并对功能菌的组成进行研究。[方法]利用厌氧连续流反应器,以养殖场新鲜鸡粪为种泥,控制和保持反应器内ORP为-337～-230 mV,pH 6～7,温度30～35℃,富集厌氧除磷功能菌。跟踪监测反应器进出水的总磷（TP）、磷酸盐（PO43--P）和氨氮（NH2-N）去除率。当TP的去除率达到60.89%时,取样进行PCR-DGGE分析,用MEGA 4.0软件构建系统进化树。[结果]鸡粪在反应器中连续培养140 d后,TP的去除率平均达到39.86%,大大高于文献报道的24.19%,PO43--P去除率平均达到40.82%,NH3-N的去除率平均达到34.39%;NH3-N与TP的去除率之间存在一定的相关性,厌氧条件下可达到同时脱氮（去除氨氮）除磷（还原磷酸生成磷化氢）的效果;通过对样品的PCR-DGGE分析和进化树分析,获得一种具发酵功能的乳球菌属（Lactoccus）和一种具有发酵、固氮和厌氧除磷功能的梭菌属（Clostridium）。[结论]该研究可为厌氧除磷机理提供理论依据。