转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

标准物质具有特定量值、均匀性和稳定性三大典型特征,也是其作为测量标尺的依据。转基因生物标准物质是我国转基因产品标识制度顺利实施的关键技术支撑之一。文章以转基因玉米TC1507为对象,制备了转化体特异性的新型质粒DNA标准物质pTC1507,并对其均匀性、稳定性、量值进行了评价和测定。测试结果表明,制备的质粒DNA标准物质具有良好的瓶间和瓶内均匀性,pTC1507稳定性可靠,可以在-20 ℃稳定放置6个月以上。经过测序和实时荧光定量PCR定值以及不确定度评估,pTC1507标准物质的量值是1.01±0.053。均匀性、稳定性和量值结果表明,研制的转基因玉米TC1507质粒分子标准物质符合标准物质的典型要求,可以代替传统的基体标准物质应用于转基因玉米检测,解决传统标准物质获取困难、制备复杂、成本高等不足。     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

基于流式细胞术的桫椤基因组大小测定

以买麻藤(Gnetum montanum)为内参,测定5种常用裂解液(Tris·MgCl_2、LB01、WPB、Otto’s、Galbraith’s)对桫椤(Alsophila spinulosa)细胞核的裂解效果,并通过比较桫椤和买麻藤流式细胞仪测定的荧光峰值,计算出桫椤的基因组大小。结果表明:5种裂解液中,WPB为桫椤最佳裂解液;桫椤基因组大小为6 003.25Mb,即2C DNA含量为6.138 pg。     

Functional Metagenomics to Mine Soil Microbiome for Novel Cadmium Resistance Genetic Determinants

Metal resistance genes are valuable resources for genetic engineering of bioremediation tools. In this study, novel genetic determinants involved in cadmium (Cd) resistance were identified using a small-insert metagenomic DNA library constructed from an arable soil microbiome. A total of 16 recombinant plasmids harboring 49 putative open reading frames (ORFs) were found to be associated with enhanced Cd tolerance. In addition to several ORFs for ion transport/chelation and stress response, most ORFs were assumed to be associated with non-direct metal resistance mechanisms such as energy metabolism, protein/amino acid metabolism, carbohydrate/fatty acid metabolism, and signal transduction. Furthermore, 13 ORFs from five clones selected at random were cloned and subject to Cd resistance assay. Eight of these ORFs were positive for Cd resistance when expressed in Escherichia coli, among which four ORFs significantly reduced Cd accumulation and one increased Cd enrichment of the host cells. Notably, C1-ORF1, potentially encoding a histidine kinase-like adenosine triphosphatase, was the most effective Cd resistance determinant and reduced host Cd accumulation by 33.9%. These findings highlight the vast capacity of soil microbiome as a source of gene pool for bioengineering. The novel genetic determinants for Cd resistance identified in this study merit further systematic explorations into their molecular mechanisms.     

miR172超表达载体的构建及其在micro-Tom番茄中的遗传转化

为了进一步阐明mi RNA在番茄不同生长发育阶段尤其是在果实成熟阶段的调控途径,利用聚合酶链式反应（PCR）从番茄（Solanum lycopersicum）的c DNA克隆出mi R172基因核心片段,将该基因片段,以及p CAMBIA1300-221载体通过特异性的限制性内切酶双酶切,然后将mi R172片段正向连接到载体上,转化大肠杆菌Trans5α,鉴定重组质粒正确后,利用冻融法将重组载体转入农杆菌EHA105中。再次回转大肠杆菌验证获得的重组载体,通过PCR以及双酶切鉴定是否符合预期结果,将测序结果与NCBI上的基因序列相比较,同源性高达100%。结果成功构建了适用于番茄农杆菌遗传转化的植物表达载体,继续进行转基因植株的培育和鉴定。为通过mi R172基因进一步研究果实成熟衰老机理奠定了物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物（重组N蛋白）进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化（如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等）,确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。     

利用PBR322质粒监控MSAP甲基化检测过程

[目的]监控MSAP甲基化检测过程,以控制MSAP每一反应步骤。[方法]利用PBR322质粒作为阳性对照,全程监控MSAP分析中酶切、连接、预扩与选扩体系。[结果]PBR322质粒作为阳性对照电泳时条带有限,可以根据条带有无和位置对MSAP甲基化检测过程进行全程监控,有助于发现问题的具有所在。[结论]该研究可以为MSAP技术提供可靠保障。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS：：PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中，构建重组布鲁菌M111（pBBRlMCS：：PR-PL-E）。重组菌株在28℃培养，42℃诱导表达裂解酶E，从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线，计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示，成功制备了布鲁菌菌壳，温控裂解质粒pBBRIMCS：：PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100％。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出，细菌表面出现不同程度的皱缩，细胞形态发生变化。结果表明，本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳，初步研究了其基本特性，为下-步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。