绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用。该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况。绵羊WNT5A基因的CDS区全长1062 bp,编码353个氨基酸。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。RT-qPCR研究结果表明,WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。WNT5A基因在绵羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织中均广泛表达,其中在皮肤中的表达量高于其他组织(P<0.05),而在脾脏中表达量较低。它在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05),而在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05),在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)。该结果为深入研究绵羊WNT5A基因的功能提供了重要依据,同时也丰富了绵羊基因组内容。     

基于谷氨酸棒状杆菌的茶氨酸生物合成工程菌构建

将茶树谷氨酰胺合成酶基因（CsGS1;3，GenBank登录号AB117934.1）克隆，并与穿梭表达载体pZ8-1连接，将重组质粒通过电转法转到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032感受态细胞，构建了谷氨酸棒状杆菌重组菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13022/pZ8-CsGS1;3。再将成功构建的该重组菌株经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在30℃下诱导4 h后，进行体外酶活反应。反应产物用薄层层析（TLC）检测发现有产物茶氨酸生成，经液相色谱三重四级杆串联色谱仪（LC-MS）进一步检测确定其合成产物为茶氨酸。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。     

细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析

旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用。通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况。结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852bp,具有完整的开放阅读框(852bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关。结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）基因，并进行生物信息学分析，探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列（登录号：XM_001927795.6）设计引物，PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列，使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构，并进行同源性比对及系统进化树构建，利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示，猪GRP78基因CDS区长1 965 bp，可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明，GRP78理论分子质量为72.3 ku，等电点（pI）为5.06，半衰期为30 h，其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495，肽链N端为蛋氨酸（Met），不稳定系数为32.39，属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40，总平均疏水指数为-0.496，无跨膜结构，存在信号肽序列，说明该蛋白属于分泌型蛋白；GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域：HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示，GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示，猪GRP78基因与人（登录号：NM_005347.4）、小鼠（登录号：NM_001163434.1）、大鼠（登录号：NM_013083.2）、山羊（登录号：XM_005687138.3）、牛（登录号：NM_001075148.1）核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%，氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%，各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示，GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达，在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2目的蛋白功能,探明CBF2转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR技术从基因组DNA中克隆CBF2基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2基因在E.coli Rosetta中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

Planting spacing affects canopy structure,biomass production and stem roundness in poplar plantations

To improve the productivity and wood quality of poplar plantations, effects of four planting spacing on canopy characteristics, biomass production and stem roundness in poplar plantations were evaluated over 8 years. Planting spacing influenced canopy characteristics of the plantations, and further affected the understory vegetation and plantation productivity. Understory vegetation biomass and Shannon-Wiener index were negatively correlated with leaf area index, but both diversity indexes and aboveground biomass of understory vegetation were higher in stands with a wider spacing. Tree diameter growth increased with increasing planting spacing, while the increment in plantations of square configurations (5?×?5 m and 6?×?6 m) was higher than those with rectangular configurations (3?×?8 m, 4.5?×?8 m). The highest poplar biomass production was achieved in the plantation with 5?×?5 m spacing at age 8. Moreover, poplar trees showed a tendency with better stem roundness in a square configuration. The results suggest that planting spacing not only affect canopy characteristics, understory vegetation and tree growth but also wood quality, and square configurations (5?×?5 m and 6?×?6 m) could be a better option for poplar plywood timber production at similar sites.