柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

无核柚新品种‘华柚2号’

‘华柚2号’是将‘国庆1号’温州蜜柑愈伤组织原生质体与‘华柚1号’叶肉原生质体融合创制的二倍体雄性不育胞质杂种。树势中等，花瓣短而退化，雄蕊败育，雌蕊正常。果实扁圆形，隔离种植下完全无核，平均单果质量1 232.47 g，果皮中等厚，可食率57.03%。果肉粉红色，囊壁薄，果肉化渣多汁，风味浓，可溶性固形物12.37% ~ 13.33%，总酸0.90% ~ 1.20%，固酸比10.42 ~ 14.13，维生素C 24.26 mL • L-1。在湖北武汉地区种植，果实11—12月成熟，5年生嫁接树单株产量约50 kg。     

有机态和无机态硼对柑橘枳橙砧木生长及生理的影响

以柑橘枳橙[Citrus siinensis(L.)Osb.×Poncirus trifoliata(L.)Raf.]砧木为试验材料,采用水培方式,研究有机态山梨醇—硼和无机态硼酸对其生长及各种生理指标的影响。两种形态硼都能增加砧木幼苗各部位的干、鲜质量和株高;有机态山梨醇—硼对地下部生长的促进作用尤为明显。有机态山梨醇—硼比无机态硼酸更易于向叶片等地上部位转运,有机态山梨醇—硼处理根和茎中的硼含量与无机态硼酸处理没有显著差异,但叶片中的硼含量与硼积累量均显著高于无机态硼酸处理,叶片占总硼含量的比例也显著高于无机态硼酸处理。有机态山梨醇—硼处理各部位钾、钙、镁元素含量高于对照,而无机态硼酸处理各部位元素含量则比有机态山梨醇—硼处理高。缺硼易导致叶片中糖类物质的积累,有机态山梨醇—硼比无机态硼酸能更有效地促进叶片中多糖物质的转运,有机态山梨醇—硼处理可溶性糖含量比对照和无机态硼酸处理分别降低26.3%和11.8%,淀粉含量分别降低43.5%和26.1%。在提高枳橙砧木叶片抗逆能力方面,有机态山梨醇—硼效果优于无机态硼酸,两种硼类型处理叶片中脯氨酸和伤害率均显著低于对照,有机态山梨醇—硼和无机态硼酸分别降低了20.6%和19.6%,有机态山梨醇—硼和无机态硼酸处理伤害率降低了13.3%和16.5%,有机态山梨醇—硼处理叶片中丙二醛含量显著低于无机态硼酸处理19.4%。有机态硼对改善枳橙砧木根系的生长发育的作用效果优于无机态硼酸;能有效降低叶片中碳水化合物的含量,有利于光合作用产物顺利转移;而在减少叶片有害物质的积累、保护质膜方面,有机态与无机态硼有同样的效果。     

基于双目立体视觉的重叠柑橘空间定位

果实的精准识别和定位是智能采摘面临的难题之一。基于双目立体视觉，提出了一种针对户外重叠柑橘的三维空间定位方法。首先，从双目左右图像中提取重叠柑橘果实轮廓并进行高斯平滑，通过曲率分析，找出异常的轮廓像素点；其次，依次连接相邻两个异常像素点，分析该线段上的像素点到柑橘轮廓的距离，在相邻两正常线段的交点处完成重叠柑橘轮廓分割，并通过寻找异常线段剔除对应的非柑橘轮廓像素点；再者，采用最小二乘椭圆拟合方法重建柑橘目标轮廓，并获取柑橘的中心；最后，根据双目极线约束和图像相似度，对重叠柑橘中心点进行匹配，并基于视差原理计算柑橘中心的深度值及三维空间坐标，确定重叠柑橘的遮挡关系。户外实验结果表明,所提出的方法定位误差为6.38 mm，满足柑橘采摘机器人户外采摘作业的定位精度要求。     

Y-S-Y12发酵液和生物质热解液混配对辣椒炭疽病的防治及作用机理

为探究解淀粉芽孢杆菌Y-S-Y12拮抗菌发酵液和生物质热解液混配对辣椒炭疽病的协同防病作用及其作用机理，对不同浓度生物质热解液、拮抗细菌Y-S-Y12菌株的发酵浓缩液及其混配溶液对辣椒炭疽病的抑菌作用进行检测，计算出毒力方程，根据EC50值将两种溶液进行混配，求得最佳配比。通过活体试验检测Y-S-Y12菌株对辣椒炭疽病果实的防治效果，测定叶片超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（hydrogen peroxidase，CAT）活性，并探究各药剂对辣椒炭疽病病菌菌丝的细胞膜通透性、生理代谢和菌丝形态的影响。结果显示，Y-S-Y12菌株发酵浓缩液和生物质热解液以1∶9混配具有明显的协同增效作用;混配的防效显著高于单剂，防效达到79.62%，进一步说明混配具有增效作用。混剂处理的辣椒炭疽病菌菌丝中的几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性和蛋白酶活性显著高于对照和单剂处理，处理后菌体的保护屏障被打破，使培养液的电导率、外渗液中蛋白质和核酸含量上升。混剂处理的辣椒叶片中SOD、POD、CAT酶活性显著高于对照和单剂处理，说明辣椒植株抗病性增强。综上，Y-S-Y12菌株发酵液和生物质热解液混配对辣椒炭疽病有协同防病作用，可能是因为Y-S-Y12菌株具有破坏辣椒炭疽病菌菌丝和诱导辣椒植株抗病性作用。研究为辣椒炭疽病无公害防治提供理论依据。     

柑橘褐斑病菌对不同抗性柑橘品种防御酶活性的影响

以柑橘褐斑病高抗品种Lw8,中抗品种L2,高感品种Lw14为实验材料,通过孢子喷雾法使柑橘褐斑病菌感染柑橘叶片,研究接菌0d、1d、2d、3d、6d、8d、10d时,柑橘叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHT)酶和β-1,3葡聚糖酶(GLU)含量及活性变化规律与品种抗病性的关系。结果表明,接种前,两个抗病品种Lw8、L2中的POD、SOD、PAL、PPO 、GLU、CHT活性显著高于高感品种Lw14,CAT活性则与高感品种Lw14相近；接种后,3个不同抗性品种中SOD、POD、CAT、PAL、PPO 、GLU、CHT 7种防御酶活性较对照明显提高,但不同品种增加幅度不一致,除CAT外,其余6种防御酶活性均表现为抗病品种Lw8、L2增幅显著高于高感品种Lw14,且两个抗病品种一般在接菌3d内6种防御酶活性迅速升高并达到峰值；而高感品种Lw14防御酶(除CAT外)活性或增幅较小或较两个抗病品种滞后。本研究初步探讨了不同抗性品种接种褐斑病菌后7种防御酶的活性动态变化与柑橘品种抗病性关系,为进一步研究其抗病机理奠定基础。     

脐橙叶片矿质营养元素含量的分区分布特征

为揭示矿质营养元素在脐橙叶中分区分布特征,以枳砧和枳橙砧纽荷尔脐橙为对象,测定新叶和老叶的叶尖、叶缘、中部、叶基和翼叶等5个分区中10种元素(N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn和B)的含量,并分析各分区离子组成的差异。主成分分析显示,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分别解释了总变量的43.4%和21.1%,明确区分了新叶和老叶,大致区分了叶不同分区,发现新叶翼叶与其他分区具有明显差异,而老叶本叶各分区的离散程度明显大于新叶本叶各分区。两种砧木脐橙新叶中钾含量分布表现为翼叶叶基中部叶缘≈叶尖,镁含量表现为叶尖≈叶缘中部叶基翼叶;两种砧木脐橙老叶中锰含量表现为叶尖≈叶缘中部叶基翼叶,硼含量表现为叶尖叶缘中部叶基翼叶。N、P、B在新叶本叶各分区以及P、Ca在老叶本叶各分区间含量都没有显著差异。枳砧脐橙新叶翼叶Mn、Cu和Zn的含量与叶片其他分区没有显著差异,而枳橙砧脐橙新叶翼叶Mn、Cu和Zn的含量都分别显著低于叶片其他分区。结果表明,不同元素叶片分区分布特征存在明显差异,翼叶的元素含量和离子组成与叶片其他分区差异明显。     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。     

基于气象要素影响的柑橘定量滴灌模型研究

为了准确估算柑橘水肥一体化的滴灌量，实现手机APP远程操控滴灌起止时间。基于广西桂林1994—2015年柑橘物候期与同期气象条件的分析，构建了桂林柑橘不同生育期土壤需水量模型及降水量等气象要素与土壤重量含水率变化的转化算法模式，给出了柑橘滴灌量技术流程。应用模型估算广西农垦国有明阳农场（南宁）柑橘种植示范园区1997年3月干旱时的滴灌量。结果表明：应用模型估算滴灌量比传统模型节水40%以上。此结果对“气象监测预报信息+规模化生产管理设施+生产信息反馈与互动”创新服务模式有积极参考意义。