绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用。该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况。绵羊WNT5A基因的CDS区全长1062 bp,编码353个氨基酸。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。RT-qPCR研究结果表明,WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。WNT5A基因在绵羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织中均广泛表达,其中在皮肤中的表达量高于其他组织(P<0.05),而在脾脏中表达量较低。它在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05),而在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05),在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)。该结果为深入研究绵羊WNT5A基因的功能提供了重要依据,同时也丰富了绵羊基因组内容。     

水稻粒型基因研究进展及应用

水稻(Oryza sativa L.)粒型包含粒长、粒宽和长宽比等一系列农艺性状,是影响水稻稻米品质和产量的重要因素之一。随着功能基因组学和分子标记技术的发展,越来越多的粒型基因逐渐被定位和克隆。本文主要总结了目前已经克隆的与水稻粒型有关的基因：粒长基因有GS3、GL7、GL3.3等;粒宽基因有GW2、GW5、GS5等;长宽比基因有GW7、TGW3、GS2等,各个基因之间的互作关系以及各个粒型基因在生产中的实际应用。同时,指出了水稻粒型基因在进行分子植物育种时出现的问题并针对相应的问题提出解决建议。     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

牦牛CRH基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

为了探讨促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）基因在牦牛繁殖中的调控作用，试验分别采集5头成年母牦牛和5头成年母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫等组织，通过RT-PCR技术及生物信息学软件对牦牛CRH基因编码区进行扩增、克隆及序列分析，并构建系统进化树；采用实时荧光定量PCR法检测CRH基因的组织表达。结果表明，牦牛CRH基因编码区全长573 bp，编码190个氨基酸。牦牛与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的CRH基因核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%。系统进化树表明，牦牛与黄牛亲缘关系最近，并与其他物种类聚，符合物种进化规律。CRH蛋白分子式为C₉₂₀H₁₅₀₃N₂₇₉O₂₆₃S₃，分子质量为20776.95 u，理论等电点为10.95，其氨基酸组成中亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、丙氨酸（A）和精氨酸（R）所占比例较高，分别为15.8%、12.6%、12.1%和10.5%。CRH蛋白为不稳定亲水蛋白，存在信号肽和跨膜结构。CRH蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占41.05%、1.05%、8.42%和49.48%，三级结构分析结果与其相一致。CRH基因mRNA在牦牛下丘脑中表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05），在子宫中表达量最低。牦牛脑垂体前叶CRH基因mRNA表达量极显著高于黄牛（P<0.01），在卵巢、输卵管中表达量显著高于黄牛（P<0.05），而两个品种在下丘脑、子宫中的表达量差异不显著（P>0.05）。提示CRH基因在牦牛繁殖调控中具有重要作用。     

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

黏虫CYP9A113基因的克隆及外源物质对基因表达的诱导效应

黏虫是我国作物上最重要的害虫之一。细胞色素P450能够参与昆虫外源物质代谢。本研究采用RACE技术克隆了一条编码黏虫P450基因的cDNA序列,并通过Real-time PCR技术,检测了4种外源物质对该基因表达的诱导效应。该基因被国际P450命名委员会命名为CYP9A113,GenBank登录号为KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD_(50)处理黏虫3 h,LD_(10)、LD_(30)和LD_(50)处理12 h和24 h,可诱导表达CYP9A113基因;20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的LD_(10)处理黏虫12、24和48 h,LD_(30)和LD_(50)处理24 h,CYP9A113基因表达呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL香豆素处理6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇处理3、6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。