电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

电子克隆是随着基因组计划和EST计划的实施而发展起来的,是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此,电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源,介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的应用现状与前景。  

大豆分子育种研究进展

 大豆分子育种代表了大豆育种的发展方向，主要包括分子标记育种、转基因育种和品种分子设计育种三个方面。通过综合利用基因组学、生物信息学、计算机模拟与遗传育种学等多个学科的理论和方法，大豆分子育种可对大豆从表型到分子等多个层次进行遗传操作，有助于大幅度提高育种效率，最终实现大豆品种的定向遗传改良。本文介绍了中国大豆分子标记育种、转基因育种和品种分子设计育种三个方面的开创者，将国内的主要研究进展与国外相关的最新研究成果进行了综述和比较，由于知识所限对未提及的做出重要贡献的科学家在此致歉。通过比较发现，中国大豆分子育种与国外相关研究的差距普遍存在，然而，有些分子育种相关研究如基因克隆及功能研究等方面则与国外的差距正在逐渐缩小。笔者认为，大豆分子育种正朝着遗传图谱信息多元化、基因发掘规模化、分子育种技术高效化、分子育种理论系统化的方向发展。  

芝麻发育转录组分析

【目的】系统了解芝麻发育及种子形成转录组特征，丰富芝麻转录组数据信息。【方法】选用6份芝麻样品（5个不同芝麻品种的完整植株、1份不同发育阶段的芝麻籽粒），构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq双端测序及生物信息学分析。【结果】共获得原始数据12.69 Gb，有效数据8.80 Gb。通过de novo拼接获得了长度大于100 bp的转录物26 837条（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/TSA.html，登录号：JP631635—JP668414）；转录物总长度18.35 Mb，平均长度683 bp，N50长度1 006 bp。转录物注释结果显示，25 331条转录物序列具有同源比对信息；1 506条转录物序列无匹配（no hits）序列信息，可能为芝麻特有的基因序列。采用COG、GO功能分类工具可将已注释转录物序列划分为24个或42个功能类别，共涉及物质及能量代谢、信号传导、转录调控及防卫反应等诸多生理生化过程。通过比较不同材料间转录物序列及表达水平，初步确定1 277条序列在种子形成过程中表达量下调10倍以上，990条序列仅在芝麻植株中表达而未在籽粒中表达；660条序列在种子形成过程中表达量上调10倍以上，296条序列可能与种子形成特异相关。【结论】利用高通量测序技术对芝麻野生种和不同栽培种现蕾期植株以及种子形成过程的转录组进行研究，揭示了芝麻发育转录组的整体表达特征，在得到大量芝麻转录组unigene序列的同时，获得了一批在芝麻生长发育及籽粒形成过程中有重要功能的基因序列。为深入开展芝麻生长发育、籽粒发育相关基因功能及调控以及芝麻分子标记开发等研究提供了丰富的数据资源。  

粘质沙雷氏菌几丁质酶(ChiC)基因克隆及其生物信息学分析

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescensATCC14041)中克隆出几丁质酶基因(ChiC),将回收纯化的PCR产物与载体pMD18-T连接,构建成的重组质粒命名为pMD-Ch iC,将重组质粒转化到受体E.coliDH5α中进行克隆,经BamHI和NheI双酶切验证、核酸序列测定证实,重组质粒pMD-Ch iC含有几丁质酶C基因(ChiC)。利用生物信息学的方法,推测该粘质沙雷氏菌ChiC基因编码的蛋白质由480个氨基酸组成。预测该蛋白的等电点为5.63,分子量约为52kD。针对粘质沙雷氏菌中的几个几丁质酶基因做了进化树,进而验证了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶(ChiC)在沙雷氏菌几丁质酶中的分类;同时对粘质沙雷氏菌几丁质酶C(ChiC)蛋白的高级结构作出了预测,得到其编码的属于18家族的蛋白质高级结构图谱。  

柽柳泛素结合酶基因(E2s)的序列分析及功能验证

从柽柳(Tamarix androssowii)cDNA文库中测序得到一条长度为607bp、编码146个氨基酸的全长cDNA基因序列,对该基因序列进行生物信息学分析,确定其属于泛素结合酶(Ubiquitin conjugating enzyme,E2s)蛋白家族。采用根癌农杆菌介导法对烟草进行E2s基因的遗传转化,通过分子检测证明,该基因整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。对各转基因及非转基因对照烟草进行干旱胁迫处理,通过调查相对电导率和相对生长量的变化,研究E2s基因抗旱方面的功能。结果表明,在非干旱胁迫条件下,各转基因株系与对照烟草的相对电导率差异不明显,各株系的相对电导率随着干旱胁迫时间的延长均呈上升趋势,且均小于对照烟草;干旱胁迫20d时,各转基因株系的相对电导率平均为9.12%,非转基因烟草的相对电导率则为12.35%,并且非转基因烟草的相对生长量仅为45.4%,而各转基因株系的相对生长量平均为141.1%,说明E2s基因的导入提高了转基因烟草的耐旱性。  

猪OLR1基因克隆及生物信息学分析

设计猪氧化低密度脂蛋白受体1(OLR1)基因编码区全长引物,从猪脂肪组织中扩增OLR1基因编码区全长序列,对其蛋白质序列进行比对分析,预测蛋白质信号肽位点及结构域并研究该基因密码子使用偏好性。结果表明:猪OLR1基因编码区全长为825 bp,共编码273个氨基酸,猪OLR1基因与牛同源性最高(84%),其次是人(79%)、大鼠(51%)和小鼠(27%)。猪OLR1蛋白38~60位氨基酸为信号肽所在位置,144~256位氨基酸正是C型凝集素家族共有结构域;OLR1基因密码子A U含量(61.2%)远高于G C含量(38.8%),而且偏向使用A/U结尾的密码子(占76.53%),这可能影响到OLR1基因的表达水平。  

大豆CAPS标记快速开发方法的建立与优化

采用生物信息学方法,分析大豆SNP位点序列信息,选择合适的内切酶,进行混样PCR和酶切预筛选,建立了大豆CAPS标记的快速开发方法—gspCAPS(Genome Sequence Pool,CAPS)。设计合成了61对引物,在9个大豆品种中对gspCAPS方法进行了评测。结果表明,该方法显著提高CAPS标记开发的效率,传统CAPS方法效率为40.98%(25/61),该方法效率高达86.21%(25/29),并且标记开发的正确性没有降低,维持在100%。本研究所建立的gspCAPS方法效率高、周期短、成本低,对高效开发CAPS标记具有重大的指导意义和广阔的应用前景。  

玉米Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定

[目的]克隆玉米Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因，为研究此类基因在玉米非生物胁迫抗性机制中的功能奠定基础。[方法]采用电子克隆、RT—PCR、生物信息学方法，从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因，并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。[结果]利用电子克隆方法，从玉米中克隆出1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1；Zm-SOS1基因的开放阅读框长3411bp，编码1136个氨基酸；序列分析表明，ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOSl、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61％和82％；RT—PCR分析表明，ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强，表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSDS1是一个公认的质膜型Na^＋／A^＋逆向转运蛋白基因，并可能参与玉米的非生物胁迫反应。  

生物信息学在蛋白质组学上的应用

蛋白质组学是后基因时代标志性的研究新领域,其快速发展很大程度上依赖于生物信息学的蓬勃壮大。从生物信息学与蛋白质数据库、蛋白质分析、蛋白质功能的联系3个方面,对生物信息学在蛋白质组学上应用的研究进展进行综述。  

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象，利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列，并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列；利用生物信息学技术，对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性，蛋白质序列的跨膜区，亚细胞定位，亲水性，潜在信号肽剪切位点，糖基化位点，磷酸化位点，编码产物进行功能预测分析，及其编码蛋白的二级结构，三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp，包括1 212 bp的编码区序列，编码403个氨基酸。同源性分析发现，绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高，分别达到78.77%和92.51%，而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白，相对分子量为44079.0Da，理论等电点为4.91，无信号肽序列和跨膜区；亚细胞定位主要在细胞核，不属于分泌蛋白；预测含有33个磷酸化位点，7个糖基化位点，具有两个WW结构域，二级结构以无规则卷曲为主，三级结构显示，YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。