ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测 方法的建立及初步应用

以纯化的大肠埃希菌K99菌毛蛋白为包被抗原,建立检测大肠埃希氏菌K99 Ig G抗体的间接ELISA方法。确定间接ELISA的最适反应条件,即抗原包被的ELISA板4℃过夜,最适抗原包被浓度为4.94μg·m L-1,兔抗体稀释倍数为1:50,猪抗体稀释倍数为1:200,确定最佳封闭液为100 g·L-1脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5 h,血清反应时间为1 h,二抗最适浓度梯度为1:2000,反应时间为37℃0.5 h,底物室温反应时间为37℃10 min,阴阳性临界值兔血清为0.25、猪血清为0.35。试验证实该间接PPA-ELISA方法的特异性强、敏感性高、重复性好,可以为疫苗效力检验和流行病学调查提供参考方法。     

用PPA-ELISA测HCLV抗体和抑制法测HCLV

对早期建立的PPA-ELISA测猪瘟兔化弱毒(HCLV)抗体和PPA-ELISA抑制法测HCLV毒价的2种方法作总结性回顾。前者用于猪瘟的免疫监测,以抗体的分布曲线显示HCLV的免疫效果,出现低谷为免疫力不足,出现特异高峰则可能有强毒侵入;如群体保护率小于50%,表明免疫失败。后者主要用于细胞培养液小样的HCLV毒价测定,方法简单,一次能测多个样品。检测结果表明,在现用的疫苗中抑制价高的,完全有可能用16万或20万倍稀释通过兔体测毒。对此,建议将兔体半数反应量(RID50)标准提高至16万或20万倍稀释,一次通过,免疫剂量用400RID50,与国际接轨,达到早日消灭猪瘟的目标。     

ETEC K88菌毛蛋白抗体PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的大肠埃希菌K88菌毛蛋白为包被抗原,建立了检测大肠埃希菌K88IgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件,即最佳抗原包被浓度为1μg/mL,兔抗体稀释倍数为1∶10,猪抗体稀释倍数为1∶100,确定最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5h,血清反应时间0.5h,二抗反应时间1h,底物室温反应时间为15min,阴阳性临界值兔血清为0.33、猪血清为0.45。证实该间接PPA-ELISA方法特异性强、重复性好、敏感度高,可以作为疫苗效力检验和流行病学调查的参考方法。     

福建省1996年猪瘟抗体PPA—ELISA检测

本文应用中ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ对福建省十个县２５９９份羊检血清作猪瘟抗体检测。结果表明本省猪瘟疫苗群体这８２．５％，仔猪经二次免疫，１５９日龄猪瘟抗体ＯＤ值仍保持０．３群体保护率仍保持７７％。     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白的截短表达与PPA—ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪伪狂犬病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的PRVSA株基因组序列,PCR扩增了长约1070bp的gD基因片段,将目的片段定向克隆到pET30a原核表达载体,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组gD蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,建立了检测猪伪狂犬病毒抗体的PPA—ELISA检测方法。该方法与其他7种常见猪病病毒（CSFV、PPV、PRRSV、JEV、PCV－2、PEDV、TGEV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5％,批间重复性试验的变异系数小于10％;与IDEXXgD-ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92．0％、95．1％和88．1％。本研究建立的PRVgD-PPA—ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的免疫猪群抗体监测、快速诊断和PRV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

用PPA-ELISA等5种方法检测布病抗体敏感性

以布病S_2苗免疫猪,7,21和35天采血,血清457份。以4种常规方法检测,RBPT和SAT两法的检出率高于其他方法。血清置-80℃冰箱冻存2个月后,取84份,用PPA-ELISA及4种常规方法检测,SAT的阳性率为90.5％,高于其他方法,差异显著(P<0.05)。PPA-ELISA和RBPT分别居第2位(87.2％)和第3位(85.7％)。PAT和CFT阳性率最低。检出抗体滴度比较,SAT高于PPA-ELISA,而后者又高于PAT。SAT、PPA-ELISA和RBPT三者之间符合率均较高(88％)。PPA,ELISA检测猪布病免疫抗体的敏感性低于SAT而高于其他方法。本文还探讨了5种方法的优缺点。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

猪瘟PPA-ELISA和Dot-ELISA检测猪瘟抗体的比较及其应用

随着论断技术的快速发展,猪瘟的抗体检测方法也不断增多.血清中和试验、免疫琼脂扩散试验、对流免疫电泳、荧光抗体技术、聚合梅链式瓜等方法都已用于猪瘟的抗体检测,这些方法特异性强、敏感性高,但操作烦琐、费时,而且有些方法的技术和设备条件要求较高,在基层难以推广使用.尤其对于模化猪场大批样品的快速检测,更需要快速和操作简便的论断检测方法.酶免疫技术中的酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为是目前检测猪瘟抗体较好的一种方法,该法简便、快速、敏感、特异快,并且试剂盒已商品化.因此我们选用了葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附试验(PPA-FLISA)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)技术在规模化猪场进行了抗体检测的比较试验和实际应用.现将试验情况报告如下.     

兔病毒性出血症(RHD)母源抗体的测定

应用本课题组研究建立的PPA-ELISA简接法,对孕期和产后不同阶段的RHD血清抗体测定,结果表明.仔兔通过胎盘及初乳获得母源抗体;抗体滴度与母兔相当;母源抗体在30天内降至阴性水平。