鸡4种主要RNA病毒病多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组核苷酸序列,通过序列比对获得AIV、IBV、NDV、IBDV的相对保守序列。根据每种病毒的保守序列利用生物学软件分别设计3对特异性引物,4种病毒共设计12对引物,并对12对引物进行模拟筛选,获得匹配最佳的4对引物。对获得的最佳匹配引物进行单项PCR验证,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶使用量;经特异性、敏感性及简化PCR试验,最终建立了简易复合PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法可同时扩增出4条大小与设计相符的特异性片段,即IBV(146 bp)、NDV(215 bp)、IBDV(345 bp)、AIV(435 bp);建立的复合PCR方法具有较强的敏感性和特异性,能检测出100 pg AIV、IBV、IBDV的cDNA和100 fgNDV的cDNA;将三温热循环改进为二温热循环,即将退火和延伸过程合为一步(62℃),大大缩短了反应时间。     

鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1、N和M基因的克隆与表达

为研究鸡传染性支气管炎病毒DNA疫苗,构建了表达IBVS1、M和N基因真核表达载体,并且BHK-21细胞和小鼠体内进行了表达检测,将IBVSX16株的S1、N和M基因克隆入真核表达载体pVAX1,构建IBV真核表达载体pVAX1-16S1、pVAX1-16N和pVAX1-16M。体外转染BHK-21细胞,用间接ELISA检测到目的蛋白表达,用构建的3个表达载体免疫小鼠,从小鼠血清中检测到了抗IBV抗体,初步证实用IBVS1、N和M基因作为核酸疫苗免疫动物,可以激活机体免疫应答。     

IBV抗体的银加强金标免疫技术检测

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的银加强金标免疫技术（SECGA）；【方法】将胶体金标记纯化的兔抗鸡IgG，然后将IBV纯化抗原包被于NCM上（0.4ug/片），封闭后在膜片上滴加不同稀释度（10×2X）的血清，作用10分钟，洗涤后浸于1：4金标兔抗鸡IgG液中作用60分钟，再银染10分钟观察结果；【结果】SECGA能检出IB阳性血清的抗体＞10×27，而不与ND、EDS76、IBD阳性血清发生有意义的交叉反应（抗体滴度＜10×22）。对鸡IgG的最小检测量为0.88ng。用SECGA、气管环中和试验、ELISA试验检测IB抗体有明显的相关性；【结论】银加强金标免疫技术（SECGA）可用于IB抗体的检测,具有敏感、特异、简单、快速、适于现场诊断等优点，适宜于广大基层单位使用。     

传染性支气管炎病毒的鉴定

试验采用鸡胚接种和气管环培养相结合的方法,对IBV毒株进行培养鉴定,IBV经鸡胚传一代后再上鸡胚气管环培养可引起气管环纤毛运动停止,应用此法可以快速地进行IBV检测。     

中药提取液对鸡传支病毒的效果研究

为筛选抗鸡传染性支气管炎病毒的中药,我们对麻杏石甘散组方进行了加减,研制形成三个中药组方,并以其为试验药物,观察其在9～15日龄鸡胚上对鸡传染性支气管炎病毒IBV-M41株的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,三个组方对该病毒均有一定的阻断和抑制作用,其中组方1的阻断和抑制作用较为突出。     

麻杏石甘散组方提取液对鸡传染性支气管炎病毒影响的研究

为筛选抗传染性支气管炎病毒中药,对麻杏石甘散组方进行加减,研制形成3个中药组方,并以其为试验药物,观察其在9~15日龄鸡胚上对鸡传染性支气管炎病毒IBV-M41株的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,3个组方对该病毒均具有一定的阻断和抑制作用,其中,组方1的阻断和抑制作用较为突出。     

5株传染性支气管炎病毒分离株的鉴定和血清分型

从四川、重庆和广东3个不同地区，不同时间发病的肉鸡中分离出5株病毒．通过鸡胚发育试验、NDV干扰试验、动物回归试验和感染后鸡血清中抗体水平变化确定这5株病毒均为传染性支气管炎病毒．血清中和试验表明，这5株病毒血清型与北京分离的A2株一致，而与H52、H120、M41、T和Holte株不同．该研究结果证实了鸡传染性支气管炎病毒类4／91毒株在我国华南和西南地区的流行．     

化学合成面筋蛋白外啡肽B5对鸡淋巴细胞体外免疫活性的影响

面筋蛋白外啡肽B5是一种通过面筋蛋白的体外酶解所获得的阿片肽,具有一定的免疫学功能,有望成为一新型免疫增强剂。本研究通过化学合成方法制备,并将其加入鸡外周血单个核细胞中,以观察其对淋巴细胞的增殖效应和对IFN-γ和IL-4mRNA水平影响。结果显示,化学合成获得了高纯度的外啡肽B5(HPLC质量分数大于98.435 7%);外啡肽B5能显著促进鸡淋巴细胞的增殖,并能显著提高IFN-γ的mRNA水平(P0.05),对IL-4mRNA无显著影响。     

Cloning and Prokaryotic Expression of Nucleoprotein Gene of Infectious Bronchitis Virus (IBV)ZZ2004 Strain

This experiment was conducted to clone and express the nucleoprotein (N) gene of infectious bronchitis virus (IBV). A pair of specific primers was designed and synthesized according to the published sequence of IBV ZZ2004. RNA of IBV ZZ2004 strain was extracted and the fragment of about 1.23 kb was amplified by RT-PCR, which was correct fragment.The fragment was inserted into the cloning vector pGEM-T to construct pGEM-T-N, and nucleotide sequence was determined by dideoxy-mediated chain termination method. The pGEM-T-N was excised by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ, and inserted into the expression plasmid pGEX-6P-1 to obtain the recombinant expression vector pGEX-6P-1-N, which was used to transform into E.coli BL21 (DE3) competent cells. Then the recombinant pGEX-6P-1-N was induced by IPTG, SDS-PAGE and Western blotting results confirmed that the gene had been expressed in recombinant pGEX-6P-1-N, and the protein was soluble. The expression product could specially react to the anti-sera of IBV which showed that N protein had some biological activity. This study had laid a solid foundation for production of diagnostic reagents for testing IB and new type IB gene engineering vaccines.     

2010—2013年我国鸡传染性支气管炎病毒分离株S1基因分子特性分析

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30株传染性支气管炎的S1基因序列与常用疫苗毒株和GenBank中代表性IBV毒株的对应基因序列进行比较,结果发现:1)30株野外分离株可分为2个基因型:LX4型和TW型,分别占总数的93.3%和6.7%;2)LX4型分离株S1基因和氨基酸序列与常见疫苗毒株序列差别很大,同源性仅分别为77.6%~86.3%和75.8%~85.7%;3)分析S基因裂解位点时发现同一基因型毒株的裂解位点氨基酸序列高度趋同,且型间差异性较大。可见,近年来我国主要IBV分离株属于LX4型,并且彼此间亲缘关系较近,与我国现用传染性支气管炎主要弱毒疫苗和国外参考株属于不同的基因型,这可能是导致疫苗免疫失败,传染性支气管炎(IB)在鸡群中爆发的主要原因。该研究结果为筛选针对我国目前流行IBV毒株的疫苗株提供参考。