改良培养基对体外培养生精细胞增殖分化的影响

探讨改良培养基对体外培养小鼠生精细胞的增殖分化效应。根据培养基的不同分为:A组(基础培养液组);B组[基础培养液+胶质细胞神经营养因子(GDNF)+表皮生长因子(EGF)组];C1、C2和C3组[A组+20%、40%、80%睾丸液(TA)];D1、D2和D3组(B组+20%、40%、80%TA)。采用上述8种培养基对7~8日龄小鼠生精细胞进行体外培养,通过细胞形态学观察、细胞存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨TA、GDNF和EGF对小鼠体外培养生精细胞的增殖分化效应,结果如下:(1)形态学观察表明,B组生精细胞生长速度快,形态好,细胞集落多,A组最差;C组和D组细胞传代后培养时间最长,可达4个月。(2)生精细胞存活率结果显示,培养20 d的B组细胞存活率显著高于其他各组(P0.05),C、D组在各培养阶段与A组间无显著性差异。(3)TP1/P19培养15 d后B组的TP1/P19显著高于其他各组(P0.05),其他各组间均无显著性差异。(4)单倍体精子细胞比例结果表明,培养15 d后的B组单倍体细胞比例显著高于其他各组(P0.05),其他各组间单倍体细胞比例均无显著性差异。GDNF和EGF可显著提高生精细胞体外培养的增殖分化效应,而睾丸液可显著延长生精细胞体外培养时间。     

GFRα-1 is a reliable marker of bovine gonocytes/undifferentiated spermatogonia: A mini-review

Identification of the specific biomarkers is of great importance to enrich and expand the gonocytes or spermatogonial stem cells (SSCs) in livestock. The glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family receptor alpha-1 (GFRα-1) is a conserved marker of the gonocytes/SSCs in multiple species including rodents, primates and human; however, its expression in bovine gonocytes/SSCs is debated. Recently, we and other teams clearly demonstrated the expression of GFRα-1 in bovine gonocytes/SSCs. This is useful for bovine gonocytes/SSCs-related research or application. Nonetheless, new methods still need to be developed to identify the undifferentiated spermatogonial subsets in large livestock and elucidate their spermatogenic potency.     

细胞因子与激素对山羊卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

本试验研究了在培养液中添加不同浓度的GDNF、LIF、SCF及其不同组合对山羊卵母细胞体外成熟与卵裂的影响。结果表明:GDNF、LIF、SCF对山羊卵母细胞体外成熟有极显著影响(P<0.01),不同浓度间无显著影响(P>0.05),添加LIF卵母细胞体外成熟率极显著高于GDNF、SCF(P<0.01),添加GDNF、LIF对卵裂率有显著影响(P<0.05),添加SCF对卵裂率无影响(P>0.05);GDN+LIF+SCF组和GD-NF+LIF组卵母细胞成熟率极显著高于LIF+SCF和GDNF+SCF组(P<0.01),添加GDNF+SCF和LIF+SCF对卵母细胞体外成熟率无显著差异,可见,LIF和GDNF对山羊卵母细胞体外成熟有协同作用。胚胎的早期发育上GDNF+LIF+SCF组优于GDNF+LIF组优于LIF+SCF也优于GDNF+SCF,均能显著提高卵裂率。     

不同培养条件对牛精原干细胞增殖的影响与特性鉴定

探索血清浓度以及干细胞因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对牛精原干细胞体外增殖的影响,并对其进行鉴定。试验1：以高糖DMEM为基础培养液,添加浓度为0%、2.5%、5%和10%的胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）,分为4个试验组。结果表明,血清浓度影响牛精原干细胞的体外增殖,添加2.5%的FBS比较合适。试验2：培养液中加入不同浓度的SCF、LIF及GDNF,可增加精原干细胞的数量,其中加入20μg/L SCF、80μg/L GDNF、10μg/L LIF后,与对照组比较能显著提高精原干细胞数（P〈0.05）。采用碱性磷酸酶染色、细胞免疫组织化学染色和RT-PCR对牛精原干细胞进行鉴定,结果碱性磷酸酶染色呈弱阳性;细胞免疫组织化学染色Integrinβ1阳性、c-kit阳性;经RT-PCR扩增,获得了120 bp的Gfrα1序列和280 bp的c-kit序列,与预期的产物大小一致。因此,培养液中添加2.5?S、20μg/L SCF、80 ng/mL GDNF、10μg/L LIF对精原干细胞的增殖有利。     

GDNF mRNA在猪睾丸不同发育阶段的表达

为了进一步探索GDNF mRNA的表达与精液品质、精液量甚至精子发生之间的关系,以及GDNF在睾丸发育和精子发生中的作用提供一些新线索,并且可能为治疗男性不育提供新的思路,研究采用半定量RT-PCR法研究了胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)在不同发育阶段的公猪睾丸中的表达。结果表明:仔猪出生后2周,睾丸中即存在GD-NF mRNA的表达;随着年龄的增加,GDNF mRNA水平持续升高,其中第6月龄达到高峰。说明GD-NF mRNA在公猪睾丸的支持细胞中表达,随着年龄的增长,GDNF表达量增加,可能以旁分泌的形式调节精子发生;GDNF可能参与了仔猪睾丸的发育和精子发生的调控,但其具体的作用机制还有待于进一步研究。     

成年大鼠面神经低位切断后面运动神经元的死亡进程及GDNF的保护作用

目的 观察大鼠面神经低位切断伤后,大鼠面运动神经元死亡的时间进程和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)局部应用对伤后面运动神经元的作用.方法 手术制作大鼠右侧面神经的低位切断伤 GDNF模型,左侧为切断伤 PBS液对照.用HE、甲苯胺蓝染色技术观测面运动神经元死亡情况及其形态学变化.结果 面神经低位切断伤可引起面运动神经元死亡且于伤后4周时达到高峰.损伤后1、2、4、6周时,GDNF侧神经元数量明显多于对照侧(P＜0.01).伤后2、4、6周时,GDNF侧的神经元数量较第1周时均减少(P＜0.01),而第4周与第6周的神经元数量差异无统计学意K(P＞0.05).结论 局部应用GDNF对低位切断伤后的面运动神经元有显著的保护作用,这种作用在损伤4周内完全发挥.     

FSH调节仔猪睾丸支持细胞GDNF表达的信号机制

本研究旨在阐明FSH调节睾丸支持细胞GDNF表达的信号机制.以体外培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过加入不同信号通路因子,采用RT-PCR和Western blot等方法研究了FSH对支持细胞GDNF表达的调节.结果:(1)FSH(50 ng· mL-1)处理支持细胞,可迅速激活MEK激酶,随着FSH刺激时间的延长,ERKl/2活性逐渐升高(0～30 min)；(2)dbcAMP(100 μmol·L-1)同样能迅速激活MEK激酶,诱导GDNF蛋白、mRNA的表达；ERK1/2活性随dbcAMP刺激时间的延长逐渐升高(0～30 min)；(3)加入MEK1/2的抑制剂U0126和PKA的抑制剂H89,则显著抑制了FSH对GDNF的激活作用,GDNF蛋白、mRNA和活性明显下降；(4)加入PKA的抑制剂H89(10 μmol·L-1),则明显抑制了FSH诱导的ERK1/2磷酸化的激活作用.结果表明,FSH可通过cAMP-PKA激活ERK级联调节支持细胞GDNF的表达.     

GDNF对缺气损伤的体外培养新生儿大鼠背根节神经元的作用

运用体外缺气损的细胞模型，研究GDNF对损伤的新生儿大鼠背根节神经元（DRG）是否有保护作用。采用原代培养的方法，用N1无血清培养基分离培养DRG神经元24h后，加入含20μg/mL GDNF的无血清培养液，然后液体石蜡封闭培养液，继续培养4，8，12，24h，分别做MTT实验检测细胞活性OD值，台盼蓝染色记数，细胞部蛋白测定活性OD值，台盼蓝染色记数，细胞总蛋白测定以及形态学观察突起生长状况，结果表明：（1）封闭12h后GDNF组的DRG细胞存活数同对照组相比有显著升高（＊＊P＜0．01），其余各时间点均无显著性差异，缺气损伤8h和12h后，GDNF组的DR细胞总蛋白较对照组显著升高（＊＊P＜0．01，＊＊P＜0．05），其余各时间点均无显著性差异；（2）各时间点DRG细胞活性及突起长度的变化差异均不显著，缺气损伤一定时间的GDNF对新生大鼠DRG细胞的存活数及细胞总蛋白有明显的保护作用，而对细胞活性及突起的生长则没有明显的促进作用。     

GDNF和LIF对小鼠精原干细胞体外增殖的影响

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和白血病抑制因子（LIF）对小鼠精原干细胞（SSCs）体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶（AP）染色和RTPCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF（添加量为0,10,20,40 ng/mL）或LIF（添加量为0,500,1 000,1 500 U/mL）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加GDNF和LIF（各因子单独添加量两两组合）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,4,5天取样,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测GDNF、LIF对SSCs体外增殖的单因子效应和配伍效应。【结果】与对照组相比,不论培养时间如何,单独添加20和40 ng/mL的GDNF可以显著促进SSCs增殖(P＜0.05),而单独添加不同量LIF对SSCs增殖的影响不显著(P＞0.05);同时添加20 ng/mL GDNF和1 000 U/mL LIF可以显著促进SSCs的增殖,在该条件下当精原干细胞接种密度为(6×10⁴)～(10×10⁴) mL^-1,共培养5 d时,其OD₄₉₀值为0.696。【结论】DMEM/F12培养基中单独添加20 ng/mL GDNF或同时添加20 ng/mL GDNF 和 1 000 U/mL LIF可以显著促进小鼠SSCs的体外增殖。