Effects of DHRS3 in C2C12 Myoblast Differentiation and Mouse Skeletal Muscle Injury

Myoblast differentiation is an essential process during skeletal muscle development. C2 C12 myoblast is a commonly used experimental model to study muscle cell differentiation in vitro. Dehydrogenase/reductase(SDR family) member 3(DHRS3) is a highly conserved member in short-chain alcohol dehydrogenase/reductase superfamily and has been shown to be involved in the metabolism of retinol. Previous experimental results showed that the expression of DHRS3 increased significantly during the differentiation of myoblasts differentiation. However, the effect of DHRS3 on mouse muscle cell differentiation was unclear. The objective of current study was to determine if DHRS3 affected muscle cell differentiation, and if DHRS3 was involved in muscle regeneration. Protein expression was determined by western blot and immunofluorescence analysis. The activation and inhibition of DHRS3 increased and decreased C2 C12 myoblast differentiation respectively, which indicated that DHRS3 could affect C2 C12 myoblast differentiation. DHRS3 expression was significantly changed during muscle regeneration, with the regeneration of muscle injury, the expression of DHRS3 tended to increase first and then decrease. It suggested that DHRS3 might be involved in muscle regeneration. In summary, this study confirmed the involvement of DHRS3 in C2 C12 myoblast differentiation and mouse skeletal muscle regeneration and provided a theoretical basis for further elucidating the molecular mechanism of muscle development.     

CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

过敏是人和养殖动物常见的疾病，而且发生的频率呈现逐渐增加的趋势。为了深入了解过敏反应的机制，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建钙调磷酸酶A beta （calcineurin A beta，CnAβ）基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株，并探讨CnAβ基因对RBL-2H3细胞生长及脱颗粒的影响。选取大鼠CnAβ基因第一外显子为敲除靶点，设计并合成3个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA），构建pX459-CnAβ-sgRNA质粒，并用脂质体3000将构建好的质粒转染到RBL-2H3细胞内；利用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，通过DNA测序验证获得CnAβ基因敲除的RBL-2H3细胞株；并检测CnAβ基因缺失对细胞增殖和脱颗粒的影响。结果表明，成功构建了CnAβ单基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株；CnAβ基因缺失对RBL-2H3细胞增殖、细胞的颗粒形成以及颗粒含量无显著影响，但显著抑制由细胞表面受体介导的RBL-2H3细胞脱颗粒作用。该研究结果有助于深入了解动物过敏性疾病的发生机制，为动物过敏性疾病的预防提供了理论基础。     

山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备

以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。     

黄土丘Ⅴ区典型小流域坝控区重力侵蚀分析与预测

黄土丘Ⅴ区因其独特的土壤及地形和水文地质条件,使淤地坝坝控区的重力侵蚀严重,以至于毁坏耕地、道路和桥梁等,严重影响淤地坝效益的发挥。针对黄土丘Ⅴ区典型小流域坝控区在运行期间因沟岸崩塌和岸坡滑塌等产生的重力侵蚀导致淤地坝泥沙淤积量计算失真的问题,采用实测库容与3S技术生成库容资料和原设计库容曲线复核率定的三重复核分析方法,对运行期淤地坝坝控区域的重力侵蚀来源、诱发因素及预测进行分析。结果表明:(1)反映淤地坝淤积形态的形态判别系数α'为0.711~208.517,均值48.238,说明除阳山上小型坝小于临界数2.2为椎体淤积外,其他淤地坝为三角洲淤积;(2)坝控区形态参数如淤积面面积、周长、淤积体积及淤积形态判别系数等对重力侵蚀影响较大,给出了重力侵蚀量及侵蚀模数的计算关系;(3)重力侵蚀模数的范围184.79~812.80t/(km~2·a),均值360.68t/(km~2·a),坝控区淤积产沙模数的范围225~2 719t/(km~2·a),均值1 382t/(km~2·a)。重力侵蚀模数约占淤积产沙模数的26.1%,说明在黄土丘陵沟壑区第Ⅴ副区淤地坝的库区拦沙既有上游因水力侵蚀产沙又有库区自身重力侵蚀所致,淤地坝的运行管理既要防止重力侵蚀破坏现有耕地,又要防止淤地坝淤积出的土地被沟道基流苦咸水破坏,从而导致淤地坝淤地无法高效利用。     

3D格子Boltzmann传质模型模拟生物膜降解有机污水

以膜生物法有机污水处理为研究背景,将3D格子Boltzmann传质模型与多孔介质四参数随机生成法耦合,获得生物膜多孔介质详细的孔隙分布,进而对反应器内生化降解反应过程进行模拟计算。研究分析了生物膜孔隙率及孔隙分布对流动传质及生化反应性能的影响,并与试验结果比较证明了模型的可行性。结果表明:各方向生长概率p1-14=0.005,随着生物膜孔隙率增大,反应器内底物降解效率先增大后减小,且在孔隙率ε=0.5时达到最大,50.97%;孔隙率ε=0.5时,改变各方向生长概率重构获得5种不同结构生物膜,其降解效率随之改变,生物膜为结构1(p_(3-4)=0.01,p_(1,2,5-14)=0.005)时,底物降解效率最高,52.54%。因此,3D格子Boltzmann传质模型可用于膜生物反应器内的流动传质及生化反应过程的模拟,研究结果将对反应器的优化具有一定的指导作用。     

噁唑烷类安全剂的三维定量构效关系研究

针对25个噁唑烷类化合物,以玉米根部GST活性为衡量标准,运用三维定量构效关系中的比较分子力场分析(CoMFA)和比较分子相似性指数分析(CoMSIA)两种方法进行研究;应用20个化合物作为训练集,分别建立相应的模型,并对其进行结构和活性关系的分析。CoMFA模型的交叉验证系数q2为0.647,非交叉验证系数r2为0.999;CoMSIA模型交叉验证系数q2为0.527,非交叉验证系数r2为0.949。使用训练集以外的5个化合物进行了验证,两种模型预测值与实测值偏差较小,都显示出了较好的预测性和稳定性。研究结果可为设计新的噁唑烷类潜在的除草剂安全剂提供可靠信息。     

马铃薯块茎花色素苷合成相关R2R3 MYB蛋白基因的克隆和功能分析

植物花色素苷的合成代谢受转录因子的调控,其中R2R3 MYB为最主要的转录调控因子。本研究以彩色四倍体马铃薯为试材,克隆了R2R3 MYB基因家族里调控马铃薯块茎花色素苷合成R2R3 MYB-St AN1的3个同源基因,并利用生物信息学分析、稳定烟草遗传转化、q PCR等方法对这3个同源基因的结构和功能进行分析和鉴定,结果表明,这3个同源基因均含有R2和R3保守结构域,其主要差别在于C端由10个氨基酸序列组成的重复结构(R)数目不同,根据R数目将其分别命名为St AN1-R0、St AN1-R1和St AN1-R3,其蛋白分子量分别为28 047.91、29 458.35和31 527.60 Da,等电点(p I)分别为6.14、6.90和8.39,均为亲水蛋白。通过转化烟草发现,转入St AN1-R0、St AN1-R1和St AN1-R3后,烟草叶片叶色变化明显,其中转St AN1-R1烟草叶色呈深红色,其叶片花色素苷含量最高。进一步利用q PCR分析表明,外源St AN1使烟草叶片花色素苷合成代谢途径的关键基因(Nt CHS、Nt CHI、Nt F3H、Nt F3’H、Nt DFR、Nt ANS、Nt UFGT)上调表达,同时烟草内源Ntb HLH基因的表达显著上升;St AN1-R1可以高效地调控烟草内源Ntb HLH基因和结构基因Nt DFR和Nt ANS的表达。结果表明,St AN1的3个同源蛋白均可以调控花色素苷的合成,而只含一个重复序列R的St AN1调控花色素苷合成的能力最强。