贝莱斯芽胞杆菌HN-2的鉴定及对杧果炭疽菌的抑菌活性研究

菌株HN-2为本实验室分离得到的一株生防细菌，通过采用形态学观察结合现代分子生物学的手段鉴定生防菌HN-2为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis，以杧果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz作为靶标，其发酵上清液的正丁醇萃取粗提物的活性最好，抑菌圈大小为20.93 mm，半最大效应浓度（EC₅₀）为70.62 μg/mL。通过飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）数据结合基因检测的结果分析发现，正丁醇提取物中主要活性成分为脂肽类物质，其中含有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）和泛革素（fengycin）等。通过显微观察发现正丁醇粗提物可以造成杧果炭疽病菌菌丝扭曲、膨大、畸形，从而抑制杧果炭疽病菌的生长，菌株HN-2正丁醇提取物处理后的杧果15 d内未出现杧果炭疽病病状，对杧果果实具有较好的保护作用。贝莱斯芽胞杆菌HN-2的主要活性物质为脂肽类物质，其对植物病原真菌有较好的防治效果，具有进一步深入研究和开发应用的潜力。     

河道淤泥和堆肥蛭石混合发酵制备基质及其育苗效果

农村河道清淤产生的淤泥,体量大、有机物浓度高,处置不当会造成二次污染。现代农业的工厂化育苗需求大量的营养土,就地取土导致耕地退化。该研究利用功能微生物发酵淤泥制备育苗基质,研究不同菌株发酵基质的物理和生物学性状,基质培育西瓜苗的生长、生理参数和抗逆性能。结果表明:微生物处理均能够提升淤泥基质物理和生物学性能,同时能够提升育苗质量。其中Trichoderma harzianum T83(T83)、Bacillus amyloliquefaciens IAE(BIAE)菌株发酵基质性能最好。相较于对照处理基质的最大持水量、总孔隙度、毛管孔隙度、通气孔隙度,T83处理分别增加了64.25%、52.65%、45.05%、56.11%;BIAE处理分别增加了101.17%、45.43%、61.43%、38.14%。相较于对照处理西瓜苗的株高、鲜质量、干质量、叶绿素含量、根系活力、根际真菌、细菌数量,T83处理分别增加了66.85%、52.07%、72.16%、43.13%、54.93%、110.62倍、1.63倍;BIAE处理分别增加了80.40%、57.34%、82.37%、54.88%、46.40%、67.26%、2.60倍、2.94倍。T83和BIAE处理西瓜苗叶片过氧化氢酶和超氧化物歧化酶酶活显著增加,根系丙二醛含量显著降低。真菌菌株T. harzianum T83和细菌菌株B. amyloliquefaciens IAE发酵淤泥,能够显著提升其农用品质,为淤泥高附加值化农用提供一条可行的途径。     

四种Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫毒力测定及中肠组织病理学变化

为更好地了解苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis毒素蛋白对二点委夜蛾Athetis lepigone的毒力以及作用机理,通过饲喂含有Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab和Vip3Aa四种不同Bt毒素蛋白饲料,测定Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的毒力,并观察取食4种毒素蛋白后幼虫中肠组织的病理学变化。结果显示,二点委夜蛾幼虫取食毒素蛋白后72 h,Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性较高,校正死亡率为84.7%和76.4%;Vip3Aa和Cry2Ab毒素蛋白的毒力较弱。二点委夜蛾幼虫取食4种Bt毒素蛋白后,中肠柱状细胞微绒毛脱落,杂乱地分散在肠腔内,杯状细胞变形和腔内微绒毛脱落,线粒体和内质网等变形破裂,细胞核的核膜消失、核质凝聚和形状发生变化,经Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白处理后中肠细胞的病变症状和速度明显高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白处理。表明Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫杀虫活性较高,显著高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白,且对其中肠细胞的破坏作用也较强。     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

生防菌解淀粉芽胞杆菌Ht-q6可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效

为了研制一种高效、安全及无污染的生防菌剂，本文以核桃内生生防菌解淀粉芽胞杆菌Ht-q6为材料，通过室内筛选和田间试验，确定了生防菌Ht-q6可湿性粉剂的最佳助剂配方及对番茄叶霉病和灰霉病的田间防效。结果表明，可湿性粉剂的最佳配方为载体硅藻土（85%）、润湿剂十二烷基苯磺酸钠（6%）、分散剂木质素磺酸钠（6%）、稳定剂KH₂PO₄（1.0%）、紫外保护剂抗坏血酸（1.0%）。该粉剂芽胞含量2.28×10¹⁰ cfu/g、杂菌率0.5%、pH 5.8、细度93.5%、干燥减量2.5%、润湿时间45 s、悬浮率85.6%，符合国家标准值，质量合格。同时采用喷雾法测定了不同浓度菌剂对大棚中番茄病害的防治效果，结果表明，稀释200×（制剂用量225 g/667m²）的可湿性粉剂对番茄灰霉病和叶霉病的防效分别为77.1%和74.3%，与对照药剂75%百菌清的防效相比，叶霉病防效差异不显著而灰霉病防效差异显著。该菌剂的研制在生产实践中为番茄病害提供一条生防途径。     

柑橘砂皮病菌生防菌的筛选及其发酵条件优化

以柑橘砂皮病菌为靶标菌株,采用平板对峙法从土壤中分离到的227株细菌中获得4株对柑橘砂皮病菌有明显抑制活性的菌株,其中Y2菌株发酵液稀释5倍和10倍后,对柑橘砂皮病菌菌丝生长的抑制率分别为69.85%、61.76%。生理生化测定与16S r RNA基因序列分析结合,确定Y2菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。Y2菌株培养的最佳氮源和最佳碳源分别为蛋白胨和可溶性淀粉,最佳发酵温度28℃,转速180 r/min。Y2菌株产生的抑菌活性物质经80℃高温处理和强酸、强碱处理,活性明显下降。     

诱导Paracin1.7生成的刺激因子的分离与纯化

旨在分离纯化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中能够诱导细菌素Paracin1.7分泌的刺激因子,并探明其对副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) HD1.7细菌素生成量及群体感应相关基因luxS表达的影响。本研究通过60%硫酸铵沉淀、CM Sepharose Fast Flow弱阳离子交换柱层析中度纯化及Superdex 75凝胶层析精度纯化,将获得的层析分离物与L. paracasei HD1.7共培养,检测共培养发酵液的抑菌活性及luxS基因的转录水平,并用SDS-PAGE与Native-PAGE检测分离物质。结果表明L. paracasei HD1.7抑菌活性为126.68%;luxS基因上调表达,为对照菌株的2.43倍;刺激因子的表观分子量约为30 kDa。本研究利用三步法初步分离纯化出诱导Paracin1.7生成的刺激因子,明确该刺激因子可以启动种间群体感应相关基因luxS,为L. paracasei HD1.7的群体感应研究奠定了理论和技术基础。     

短小芽孢杆菌HB-3的分离鉴定及其淀粉酶的纯化特性研究

从湖北省襄阳市三九酿酒厂下水道污泥分离筛选得到产淀粉酶菌株HB-3,根据菌株生长形态和生理生化特征分析,初步鉴定为短小芽孢杆菌。短小芽孢杆菌HB-3在淀粉培养基上培养72 h后,淀粉酶活力达到120.0 U/mL。然后使用DEAE-52和CM-52阴阳离子交换层析柱对短小芽孢杆菌HB-3产生的淀粉酶进行了部分纯化。结果表明,短小芽孢杆菌HB-3中淀粉酶经过部分纯化后,纯化倍数为5.9,酶活力回收率为90.9%。纯化后的淀粉酶使用SDS-PAGE凝胶电泳研究,以标准蛋白为对照,计算出短小芽孢杆菌HB-3中淀粉酶分子量为56.5 kDa。同时对短小芽孢杆菌HB-3的淀粉酶进行了纯化特性研究,结果表明,该酶的酶促反应最适温度为50℃,40～60℃热稳定性良好;该酶的酶促反应最适pH为5.0,pH 4.0～6.0酸碱稳定性良好,该酶对底物淀粉的反应动力学米氏常数K_m为0.062 mmol/L,最大反应速率V_(max)为3.019 mmol/(L·min)。     

枯草芽胞杆菌微粉剂的研制及其对黄瓜白粉病的防治效果

 以枯草芽胞杆菌母药为研究对象,通过对载体、分散剂、表面活性剂、保护剂的筛选,确定了枯草芽胞杆菌微粉剂的最佳配方。其配方为:枯草芽胞杆菌母药50%、载体白炭黑20%、分散剂萘磺酸钠盐甲醛缩合物(NNO)2%、表面活性剂烷基萘磺酸盐(EFW)3%、保护剂羧甲基纤维素(CMC)1.5%、载体硅藻土补足至100%。测定结果表明:枯草芽胞杆菌微粉剂含菌量为2.11×10¹⁰ CFU·g^-1,分散指数89.56,浮游指数87.57,坡度角74°,pH 6.1,杂菌率2.1%,含水率0.67%,粒径8.15 μm,热贮分解率为4.67%,产品各项指标均达到标准。盆栽条件下,枯草芽胞杆菌微粉剂用量1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果优于治疗效果,防效分别为89.08%和84.95%;田间试验,枯草芽胞杆菌微粉剂在用量为1 000 g·(hm²)^-1时喷粉对黄瓜白粉病的保护效果为80.66%。     

生物炭对Bt Cry1Ac蛋白抗紫外能力影响

为了研究生物炭对紫外线的防护作用，以豆壳烧制的生物炭作为载体，研究生物炭对Bt Cry1Ac蛋白的吸附行为以及生物炭对Cry1Ac蛋白的紫外保护作用。使用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X-射线粉末衍射以及傅立叶红外光谱等手段对生物炭的形貌和结构进行表征。结果表明，生物炭是典型的多孔结构材料，表面具有丰富的官能团。Cry1Ac蛋白与生物炭吸附平衡时间为50 min，最合适的吸附浓度比（生物炭：蛋白）为1：100，二者吸附符合准二级动力学模型和Langmuir模型。在UVB紫外照射4 h后，生物炭与Cry1Ac蛋白复合物对棉铃虫的生物活性是单纯蛋白的4.93倍，显示生物炭具有较好的紫外抵抗效果。研究结果初步表明，制备得到的生物炭能够显著提高Cry1Ac蛋白的抗紫外能力，为后续研发耐受紫外线的农药剂型提供新材料。