油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生，并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制，本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素，评估转化子质量，并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL，转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃)，浓度为2 × 10^7~8孢子/mL，农杆菌-受体共培养温度为25℃，共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%，单拷贝插入频率为72.7%，转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体，7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体，并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术，从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

发根农杆菌介导的白花草木樨毛状根转化体系的建立

白花草木樨（Melilotus albus Medic.ex Desr.）是草木樨最常见的栽培用种之一，具有较强的抗逆性和固氮能力。为了开发一套高效的草木樨转化体系，本研究以白花草木樨为材料，以结瘤基因MaROP6为目的基因，建立了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的高效白花草木樨毛状根转化体系。结果表明：利用该方法可以在两周左右获得毛状根，其发生率可达78%，MaROP6基因的毛状根转化率可达70.8%。qRT-PCR鉴定结果表明，MaROP6转基因毛状根的平均相对表达量为对照的36.87倍。毛状根转化体系的建立为白花草木樨基因功能的验证奠定了基础。     

Localization of amino acids in germinated rice grain: Gamma-aminobutyric acid and essential amino acids production approach

Germinated rice is popularly consumed for its high gamma-aminobutyric acid (GABA) and bioactive compounds. Supporting information on how to germinate rice with high GABA content and essential amino acids is lacking. White and colored rough rice were germinated for 0, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 h. GABA, GABA substrates and essential amino acids were also investigated using GC-MS and MALDI-MSI. GABA was more concentrated after germination and shifted into the coleoptile. High correlation was recorded between germination time and GABA (0.79–0.83, p ≤ 0.01) and glutamic acid (0.88–0.89, p ≤ 0.01). Highest rates of GABA and glutamic production were observed within 48 h of germination in both rice varieties (26.12 and 34.28 mg/100g) and reached maximum value at 96 h (31.36 and 38.75 mg/100g). Colored rice germination showed higher GABA, GABA substrates and deficient amino acids than white rice. GABA and essential amino acids drastically increased after germination, supporting the consumption of germinated rice as a functional food.     

Field evaluation of antisense RNA mediated inhibition of GBSS gene expression in potato

Summary Granule-bound starch synthase (GBSS) catalyses the synthesis of amylose in starch granules. Analysis of antisense RNA mediated inhibition of GBSS gene expression in large numbers of tubers from in vitro grown, greenhouse grown and field grown transgenic potato plants revealed stable and total inhibition of GBSS gene expression in one clone. In three other transgenic genotypes partial and unstable inhibition was found. In these genotypes both GBSS activity and amylose content were remarkably reduced compared with the non-transformed control genotype. No relationship was found between the level of inhibition of GBSS gene expression and yield and dry matter content.     

根癌农杆菌介导马齿苋愈伤组织遗传转化研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为今后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3 d,OD600 nm为0.1～0.4的菌液浸染10～15 min,共培养3～5 d,共培养基附加乙酰丁香酮(AS)80 μmol·L-1,共培养后延迟3 d筛选.在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km)抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽.PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中.     

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) Ri T-DNA遗传转化丝石竹(Gypsophila paniculata)的研究

近年来,已发展出遗传转化高等植物的一些新技术,其中有些技术如脂质体融合,微注射技术和电击导入都是基于动物细胞培养方面的工作,而另一些技术是来自于植物界独特的天然转化系统,其中包括已知能遗传转化高等植物的农杆菌(Agrobacterium)的二个种,即致瘤农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes),这二个种都能够将其致病质粒Ti或Ri所携带的DNA序列(T-DNA)插入到双子叶植物细胞核基因组中。pTi诱发寄主产生根基肿瘤,pRi诱发寄主产生毛状根。二者的差别可能是毛状根可以从毛状根培养物获得具有完整的T-DNA序列的有生育能力的再生植株,而从致病农杆菌(A.tumefaciens)菌株所诱发的肿瘤很难获得再生植株。因此,利用发根农杆菌(A.rhizogenes)pRi作为遗传转化高等植物的基因克隆载体的研究和应用日益受到重视。     

提高根癌农杆菌介导的香石竹遗传转化效率的研究

以无菌苗叶片为外植体,在根癌农杆菌介导下建立并优化了香石竹5个品种的遗传转化体系。预培养2d可明显提高转化率;香石竹品种间在转化上存在差异;培养基中添加20μmol的AgNO3抑制不定芽的分化。转化植株在含25mg·L-1卡那霉素的生根培养基上培养,生根率为72 1%,GUS检测结果55%的转化植株呈蓝色,PCR扩增表明阳性率为32 2%,Southern杂交证实外源基因已整合到植物基因组中。     

热研二号柱花草转化体系优化的研究

通过柱花草Stylosanthes guianensis转化过程中预培养时间、农杆菌Agrobacterium侵染浓度、乙酰丁香酮、植物组织浸提液、脯氨酸、硝酸银和农杆菌浸入法对农杆菌、外植体及共培养基的处理,研究了提高柱花草基因转化率的方法.试验结果:用预培养2 d处理外植体,10 μmol/L乙酰丁香酮和稀释5倍的番木瓜Carica papaya浸提液预处理农杆菌,1.5 mg/L的脯氨酸处理共培养基及采用农杆菌浸入法侵染外植体可以明显地提高柱花草的转化率;对农杆菌进行稀释,用柱花草浸提液预处理农杆菌及硝酸银处理共培养基对转化率无明显的影响.用SAS软件进行2×2的卡平方(x2)检验在最佳条件下的遗传转化表明:子叶和真叶的出芽率与对照相比差异都达到极显著.     

CsFAD7基因转化烟草的研究

以"革新一号"烟草种子为试材,采用根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法将来源于黄瓜的脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)转入烟草,并在附加300mg/L氨苄青霉素(Amp)的MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA的培养基上诱导植株分化,再生芽在附加300mg/L Amp和100mg/L卡那霉素(Kan)的MS培养基上生根,获得再生植株。结果表明:Kan阳性植株经PCR检测筛选,得到转基因阳性植株,证明异源FAD基因已转入烟草基因组中。T1代经PCR-South-ern检测证明转化基因可以遗传;转基因烟草在低温胁迫下生长较好,叶绿素荧光参数F0值下降不大,Fv/Fm值保持较高,表现了对低温的耐受能力,脂肪酸分析表明,该基因可以使烟草叶片的亚麻酸含量比例升高。