罗氏沼虾细胞色素P450家族CYP302a1基因克隆及其在蜕皮周期中的表达

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1859 bp,开放阅读框(ORF)为1629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。     

山牡荆蜕皮甾酮提取及工艺优化

本文采用有机溶剂提取山牡荆蜕皮甾酮,并采用响应曲面法来优化其提取工艺。结果表明,在提取过程中的提取时间、提取液浓度、料液比都会对得率产生影响。山牡荆提取的优化是以蜕皮甾酮为衡量指标。经过优化以后,蜕皮甾酮的最佳提取工艺是:提取时间为2 h,料液比是1∶25,提取液浓度为79%,得到蜕皮甾酮的得率最高,为3. 42%。     

脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

外源油菜素甾酮处理水稻对褐飞虱取食和产卵选择性等行为的影响

为了解经油菜素甾酮处理后水稻对褐飞虱Nilaparvata lugens的抗性,通过在水稻培养液中添加不同浓度的油菜素甾酮,观察水稻对褐飞虱取食和产卵、若虫生长发育、羽化等行为的影响,评估油菜素甾酮在水稻抗虫防御反应中的作用。结果表明,水稻培养液中的油菜素甾酮可被水稻有效吸收并产生生理活性。经0.01～10μmol/L油菜素甾酮处理后水稻叶片弯曲程度均显著增加,其叶角分别为对照的3.3～11.0倍。褐飞虱取食和产卵嗜好性与油菜素甾酮处理浓度密切相关,经较低浓度0.005～0.05μmol/L油菜素甾酮处理的水稻能显著降低褐飞虱雌成虫的取食和产卵嗜好性,其产卵量为对照的35.0%～73.9%;而较高浓度0.1～5μmol/L油菜素甾酮处理则增加褐飞虱雌成虫的取食和产卵嗜好性,其产卵量为对照的1.3～1.8倍。0.01、1、5、10μmol/L油菜素甾酮处理的水稻显著降低褐飞虱若虫的羽化率,为对照的32.5%～53.3%。0.1～10μmol/L油菜素甾酮处理显著缩短褐飞虱若虫发育历期,仅为对照的94.1%～96.9%。褐飞虱若虫存活数和初羽化雌成虫体重分别仅在0.1、10μmol/L油菜素甾酮处理下显著降低。表明油菜素甾酮处理水稻可对水稻抗虫防御反应产生影响,其具有作为生态功能分子用于褐飞虱田间防控的潜力。     

沉默蜕皮激素受体对雌性中黑盲蝽生殖力的影响

中黑盲蝽Adelphocoris suturalis是一种重要的农业害虫,主要为害棉花、果树和牧草等作物。昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)与蜕皮激素(molting hormone, 20E)是调控昆虫生殖的主要因素。本研究运用基因克隆、基因沉默(RNAi)、实时荧光定量PCR(qPCR)等技术研究蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)、超气门蛋白(ultraspiracle protein, USP)在中黑盲蝽生殖调控中的作用。结果表明,中黑盲蝽EcR基因的ORF全长1 413 bp,编码470个氨基酸。预测蛋白质分子量为53.65 kD,pI值为7.79。中黑盲蝽USP基因ORF全长1 209 bp,编码402个氨基酸。预测蛋白质分子量为44.99 kD, pI值为7.94。与对照相比,注射dsEcR、dsUSP后6～18 d的中黑盲蝽体内EcR基因、USP基因在转录水平分别被显著抑制;卵巢的挂卵量分别仅有对照组的31.5%、86.6%;单雌产卵量减少36.0%～80.4%,显著低于对照。EcR和USP基因沉默后,产卵前期与对照相比无显...     

RH-2485对斜纹夜蛾幼虫蜕皮的影响

[目的]了解蜕皮激素活性类化合物RH-2485对重要害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)幼虫蜕皮的影响。[方法]用2μL100 mg/L RH-2485点滴处理斜纹夜蛾5龄幼虫,观察幼虫蜕皮和发育情况,并制作石蜡切片,在显微镜下观察被处理幼虫和对照幼虫体壁间的差异。[结果]处理6 h后,大部分试虫停止取食,接近死亡状态;12 h后,头壳开始出现脱离;24 h后,可明显观察到头壳脱离现象,新表皮和旧表皮同时存在,旧表皮松软地覆盖于新表皮之上;36 h后,表皮颜色变黑,虫体变小;48 h后,虫体仍蜕不掉旧表皮,部分呈现出"细腰"状态,或伴有后肠脱出、血淋巴流失等,多数化蛹前死亡,少数形成畸形蛹,但因不能正常羽化而死亡。同时在显微水平上观察到RH-2485处理后的幼虫体壁较对照有明显变化,在上表皮+外表皮和真皮细胞之间形成较大的间隙,真皮细胞层明显变薄。[结论]RH-2485可严重干扰斜纹夜蛾的正常蜕皮,从而导致其死亡。     

福瑞鲤β-catenin2基因的克隆与表达分析

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子,参与调控性腺发育和分化。本研究首次克隆得到福瑞鲤(Cyprinus carpio)β-catenin2的c DNA全长序列,采用荧光定量PCR技术分析了β-catenin2基因的组织表达模式及注射外源性激素对福瑞鲤β-catenin2基因表达的影响。结果表明,β-catenin2 c DNA全长3 411 bp,编码780个氨基酸,预测分子量为85. 52 ku;实时荧光定量PCR表明,β-catenin2 mRNA在血液中表达量最高,其次是性腺和脾脏;且β-catenin2 mRNA表达量在福瑞鲤性腺发育早期,随着性腺发育的成熟而升高。睾丸甾酮(T)处理后发现:卵巢中β-catenin2 mRNA表达量在10μg/g 24 h处理组显著升高(P 0. 05),精巢中β-catenin2 mRNA表达量在10μg/g和50μg/g 24 h、48 h处理组显著降低(P 0. 05)。17β-雌二醇(E2)处理后发现:精巢和卵巢中β-catenin2 mRNA表达量无显著变化(P 0. 05);以上结果表明,β-catenin2在福瑞鲤性腺发育早期是必需的。     

黄粉虫幼虫的饲养管理

生产实践中,将0～1月龄黄粉虫幼虫称为小幼虫,1～2月龄幼虫称为中幼虫,2～4月龄幼虫称为大幼虫,变蛹前幼虫称为老熟幼虫。小幼虫的饲养管理黄粉虫的卵经6～7天孵化后,幼虫头部先钻出卵壳,体长约2毫米,它啃食部分卵膜后爬至孵化箱麸皮内,并以麸皮为食,此时应去掉旧报纸,将麸皮连同小幼虫抖入箱内饲养,长到4～5毫米时,体色     

三疣梭子蟹CYP302a1基因克隆及其表达分析

细胞色素P450(CYP)302a1是昆虫蜕皮激素合成通路中的关键酶,为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,实验采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹CYP302a1全长cDNA序列(GenBank登录号:KM596851).该序列全长为3 171 bp,包含一个长度为1 626 bp的开放阅读框,编码541个氨基酸;序列分析显示该氨基酸含helix-C、helix-K、helix-I、PERF及heme-binding共5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现三疣梭子蟹CYP302a1与日本剑水蚤CYP302a1聚为一小支,再与其他物种CYP302a1聚为一支.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了CYP302a1在不同组织和蜕皮过程中的表达水平变化.结果显示,CYP302a1的表达量在Y器中最高,而在其他组织中均极低(P＜0.05);蜕皮过程中,CYP302a1在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,从蜕皮间期(C期)开始上升,至蜕皮前期的D1亚期达到最大值,随后下降.结果表明CYP302a1在三疣梭子蟹蜕皮调控中可能起着重要作用.