甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

滴度及注射方式对2型腺相关病毒载体表达效果的影响

由于腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector,AAV)本身的侵染不具有神经元特异性,其在神经系统相关研究中会存在侵染范围不符合试验要求的情况,因此本试验拟研究不同滴度和注射方式对病毒侵染范围的影响。结果显示,在注射较高滴度的AAV2-CMV-EGFP(1.3×10¹¹mg/L)3周后,其侵染范围可由延髓中缝苍白核(raphe pallidus nucleus,RPa)区域延伸至下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)区域;较低滴度(1.3×10⁸mg/L)结合压力注射的方式可以在一定程度上限制AAV的侵染范围,并且载体携带的EGFP荧光基团在637 nm波段不具有明显的假阳性信号。     

雪山草鸡感染传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)新型变异株正在我国广泛蔓延,给商品肉鸡群和蛋鸡群带来了新的威胁。本研究对一个疑似发生非典型传染性法氏囊病的地方品种雪山草鸡群进行了RT-PCR检测,并对分离的3株毒株进行了基因测序及序列分析。结果显示,引起该鸡群发病的病原是IBDV新型变异株,属于A2dB1基因型;这3个毒株的VP2高变区编码蛋白上含有IBDV变异株的特征性氨基酸,也具有IBDV新型变异株的独特氨基酸。结果提示,我国地方品种鸡群中也有IBDV新型变异株的流行,现有的部分商品化IBDV疫苗已不能有效预防IBDV新型变异株的流行。     

神经介素B及其受体NMBR参与抗A型流感病毒H1N1亚型感染的信号通路

NMB/NMBR通过调节A型流感病毒（IAV/H1N1/PR8）感染诱导的细胞因子表达而参与抗IAV的先天性免疫反应。为探究其发挥抗IAV/H1N1感染的信号通路，本文用PR8和WSN毒株分别感染MLE-12细胞和小鼠，用NF-κB抑制剂BAY11-7028单独或联合NMB处理MLE-12细胞，小鼠后腿肌内注射NMB和NMBRA，采用RT-PCR和qRT-PCR分析NMB、NMBR、IL-6、IFN-α和NP基因表达变化，采用Western blot分析NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα和NP蛋白表达的变化。结果显示，BAY11-7028可促使PR8和WSN感染的MLE-12细胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α基因表达水平均下降和NP基因表达水平上升，并降低NMB、NMBR和p-P65蛋白表达水平和提升IκBα和NP蛋白表达水平。然而，NMB联合BAY 11-7028诱导PR8或WSN感染后的细胞中IL-6和NP表达出现极显著下降和IFN-α显著上升。此外，NMB抑制PR8和WSN感染的小鼠肺组织内p-P65和NP蛋白表达水平和促进IκBα蛋白表达水平；NMBRA联合NMB抵消NMB对PR8或WSN感染后的这些蛋白表达水平的调节作用。综上表明，NMB/NMBR通过调节PR8和WSN感染的MLE-12细胞和小鼠体内的NF-κB信号通路上P65蛋白磷酸化和IκBα的表达，进而影响下游细胞因子IL-6和IFN-α基因的表达，从而发挥抗IAV/H1N1感染的先天性免疫应答反应。     

一例猪瘟与圆环病毒2型混合感染的诊治

在生猪养殖过程中,其受到多种病原混合感染的情况较为常见,这种混合感染也容易导致传统的临床诊断的误诊或漏诊,继而延误猪场疾病的治疗,造成巨大的经历损失。2020年8月初,云南省昆明市某养殖场突发疑似猪瘟(CSF)疫情,猪群临床主要表现为呼吸困难、高热,病理变化为肾脏出血,脾脏边缘梗死等,且回盲瓣纽扣状溃疡。实验室诊断结果表明,该场疫情由猪瘟病毒(CSFV)与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染所致,经过针对性治疗与防控,该场猪群恢复健康。     

METTL21C下调对小鼠成肌细胞分化的影响

为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。     

草鱼肠系膜脂肪组织高质量总RNA提取方法的研究

基于传统的酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿一步提取法,比较分析多种优化操作步骤,摸索出一种高质量提取体质量为80~150 g草鱼肠系膜脂肪组织总RNA的改良方法。试验结果显示,相较于肝脏、脾脏、肠道等脏器组织,草鱼肠系膜脂肪组织RNA丰度低,且极易在样品前处理阶段出现顽固性降解问题。探索发现,将取样量增至约30 mg,可提升RNA产量以满足常规试验需求。针对降解难题,改良常规的样品前处理技术流程,采用鲜样液氮速冻,冻样直接放入TRIzol试剂中裂解,并即刻进行长时间机械匀浆,时长约3 min等核心操作步骤,可显著降低脂肪组织样品RNA的降解。Agilent生物分析仪检测结果显示,改良方法提取的草鱼肠系膜脂肪组织RNA完整度高,关键RIN值为8.7~9.0。研究推测,长时间机械匀浆所形成的持续剪切冲击力或许有助于TRIzol试剂中的异硫氰酸胍等成分突破油滴阻碍而有效抑制内源性RNA酶。本方法提取的草鱼脂肪组织总RNA质量可满足高通量转录组测序要求。     

不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立

鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1 μmol,退火温度范围广,50~54 ℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为10³拷贝数和10²拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。     

一例黄牛狂犬病的病理学诊断

本研究凭借临床症状、组织病理学观察和尸体剖检综合诊断了1例黄牛狂犬病.发病牛临床症状表现为流涎,头颈后仰,四肢僵直,顶撞其他牛.尸体剖检可见大网膜、心内外均散在或密布出血点,左右心室腔积有大量血凝块.脑充血和水肿,脑膜静脉扩张.组织病理学检查可见脑血管严重充血,脑神经细胞多数自溶,在小脑的浦肯野细胞浆、海马多形细胞浆和脑干多极运动神经细胞浆中可见大小不等的圆形或椭圆形嗜酸性狂犬病病毒包涵体(内基氏小体).出现非化脓性脑炎,在部分小血管周围有大量淋巴细胞和少量巨噬细胞浸润,形成淋巴细胞性"管套".其他组织器官无明显病变.     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。