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1.
旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly (D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物(mannose modified chitosan,MCS),然后,经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球(MCS-PLGA-NPs)。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势(zeta)、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明,成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明,MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中,不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后,细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中,用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明,本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs,为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解,也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。  相似文献   
2.
由于腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector,AAV)本身的侵染不具有神经元特异性,其在神经系统相关研究中会存在侵染范围不符合试验要求的情况,因此本试验拟研究不同滴度和注射方式对病毒侵染范围的影响。结果显示,在注射较高滴度的AAV2-CMV-EGFP(1.3×1011mg/L)3周后,其侵染范围可由延髓中缝苍白核(raphe pallidus nucleus,RPa)区域延伸至下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)区域;较低滴度(1.3×108mg/L)结合压力注射的方式可以在一定程度上限制AAV的侵染范围,并且载体携带的EGFP荧光基团在637 nm波段不具有明显的假阳性信号。  相似文献   
3.
由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×106 CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×109 CFU·mL-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。  相似文献   
4.
类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。  相似文献   
5.
利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖,是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000菌株中,获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转化子。转接试验结果表明,转化子的抗生素抗性和绿色荧光强度有良好的遗传稳定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000菌株的致病力,且EGFP蛋白能够在植物中稳定表达。灌根法接种试验结果表明,病原菌在第1天即完成对根系的侵染,并在第6天扩散至其他组织,随后造成植株萎蔫。研究结果表明所获转化子可用于后续的病原菌侵染机理等方面的研究。  相似文献   
6.
为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。  相似文献   
7.
[目的]旨在纯化玉米ZmCCT基因缺失区段的原核表达蛋白.[方法]依据ZmCCT氨基酸序列中的CCT保守功能区,利用PCR技术获得ZmCCT基因的缺失突变体DNA片段,分别构建4个原核蛋白表达缺失区段.[结果]成功获得3个缺失区段的原核蛋白:ZmCCT1-300,ZmCCT300-540和ZmCCT1-540.[结论]该研究不仅有助于ZmCCT多克隆抗体的纯化,还将为探索ZmCCT的抗病分子机理奠定基础.  相似文献   
8.
黄萍  刘洪  王慧  周倩 《南方农业学报》2021,52(4):976-983
【目的】克隆番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)SlCmr1基因,并构建SlCmr1基因敲除载体,为研究该基因功能打下基础。【方法】根据NCBI数据库提供的番茄匍柄霉基因组信息设计引物,PCR扩增得到SlCmr1基因的DNA全长和CDS序列,并对SlCmr1基因编码的蛋白进行生物信息学分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列设计引物,分别PCR扩增SlCmr1基因的上、下游片段,通过酶切连接的方法将SlCmr1基因的上、下游序列分别插入载体pCX62,构建SlCmr1基因敲除载体。【结果】SlCmr1基因的DNA全长为3275 bp,CDS长度为3018 bp,有3个内含子,编码蛋白序列全长1005 aa,分子式为C4882H7642N1404O1499S61,分子量为111.94 kD,理论等电点为(pI)6.64,半衰期30 h,不稳定指数58.72,亲/疏水性平均值为-0.424,预测亚细胞定位于细胞核,存在2个相邻的ZnF_C2H2结构域和1个GAL4结构域,推测SlCMR1为不含跨膜区域的非分泌、不稳定可溶性蛋白。分别将SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62载体,成功构建了基因敲除载体pCX62-SlCmr1。【结论】SlCmr1可能是真菌调控色素合成的关键基因,在真菌的次级代谢产物合成中发挥重要作用。  相似文献   
9.
【目的】制备草地贪夜蛾性诱剂纳米诱芯,并开展田间诱捕试验,筛选出最佳且有效的诱芯,为草地贪夜蛾的监测和绿色防控提供参考依据。【方法】采用共溶剂法,以两亲脂质分子(DSPE-mPEG5000)为载体制备草地贪夜蛾性信息素胶体粒子,以0.22μm聚醚砜膜为缓释材料制备纳米诱芯,采用田间生物测定方法比较不同缓释载体材料和不同质量诱芯的诱蛾效果。【结果】性信息素Z9-14:OAc、Z7-12:OAc和Z11-16:OAc质量比为90:0.5:9.5时诱蛾效果最佳;草地贪夜蛾性信息素胶体粒子呈球形,尺寸在40 nm左右,具有良好的分散性。以0.22μm聚醚砜膜缓释载体的纳米诱芯诱蛾量最多,为6.07头/d;缓释载体为PVC毛细管的诱芯诱蛾量次之,天然橡胶塞的诱蛾量最少。纳米诱芯质量为2.0 mg时的诱蛾效果最佳,诱蛾量显著高于除1.5 mg外的诱芯质量(P<0.05)。【结论】纳米载体DSPE-mPEG5000可有效减缓性信息素分解和氧化变质的速度,延长挥发时间。0.22μm聚醚砜膜载体对草地贪夜蛾性信息素胶体粒子有明显的吸附作用,纳米性诱剂对草地贪夜蛾具有良好的室内引诱作用和田间诱捕效果,可进一步开发并应用于草地贪夜蛾的监测与防控。  相似文献   
10.
旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P<0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P<0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。  相似文献   
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