重组大肠杆菌肠毒素蛋白LTA_(192)-STa_(13)的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究

为研究重组大肠杆菌肠毒素融合蛋白LTA192-STa13的免疫原性,本研究将产肠毒素大肠杆菌(ETEC)elt A和est A基因定点突变后构建融合基因,进行重组蛋白LTAR192G-STaG13Q的表达。利用纯化的重组蛋白和灭活菌液分别免疫小鼠,比较不同抗原诱导小鼠体液免疫应答能力,以及体外免疫血清对毒素的中和作用。结果显示,各组免疫小鼠均可以产生高滴度抗LTA和STa抗体,其血清抗体可以通过乳汁传递给新生仔鼠,其中蛋白免疫组血清抗体效价更高。体内外中和试验证明,实验组小鼠三免后的血清能够中和LT和STa毒素对实验鼠的毒性作用,并且能够中和LT对Y-1细胞的毒性作用,蛋白免疫组血清抗体中和效价可达到1∶89.13,明显高于灭活菌免疫组。研究表明,重组蛋白LTA192-STa13对小鼠具有良好的免疫原性,能够诱导免疫鼠产生良好的体液免疫应答,可以作为ETEC亚单位疫苗的候选抗原。     

猪源产肠毒素性大肠杆菌主要毒力因子研究进展

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要细菌性病原,初生幼畜感染后常因剧烈腹泻脱水而死亡。菌毛黏附素和肠毒素是ETEC目前研究最多的2类毒力因子,随着技术手段的不断进步和研究的深入,一些新型毒力因子不断被发现,如鞭毛、非菌毛黏附素、肠聚集性耐热毒素(the enteroaggregative heat-stable toxin1,EAST1)、自转运黏附蛋白、细胞溶血素等。本综述主要针对猪源ETEC的主要毒力因子以及新型毒力的结构功能及致病性进行阐述,为进一步深入探索ETEC的致病机理提供理论基础。     

表达猪乳铁蛋白肽重组屎肠球菌对断奶仔猪生长性能的影响及其抗ETEC感染效果研究

本试验以表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌（pNZ8112-PLFcin/Ef）饲喂断奶仔猪，研究其对仔猪生长性能的影响和抗产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）感染的效果。选取28日龄体重相近的健康断奶仔猪36头，随机分为3组（重组屎肠球菌组、空载体组和培养基组），每组3个重复，每个重复4头仔猪。重组屎肠球菌组和空载体组分别饲喂添加pNZ8112-PLFcin/Ef （6×10¹² CFU/kg）和pNZ8112/Ef （6×10¹² CFU/kg）的基础日粮，而培养基组饲喂含有相同体积的GM17液体培养基的基础日粮。试验期26 d。结果显示，与培养基组相比，重组屎肠球菌组断奶仔猪的平均日增重极显著提高（P<0.01）；料重比显著降低（P<0.05）；腹泻率明显降低，肠道菌群的均匀度和多样性指数均下降。为进一步探究表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌对断奶仔猪抵抗ETEC感染的保护作用，在连续饲喂21 d后，每个重复中随机挑选1头体况相近的断奶仔猪灌服ETEC。结果发现，与培养基组相比，攻菌后重组屎肠球菌组断奶仔猪血清白细胞介素-2（IL-2）、免疫球蛋白G （IgG）含量、肠黏液中分泌型免疫球蛋白A （sIgA）水平均显著升高（P<0.05）；脾脏指数显著提高（P<0.05），但胸腺指数、肠段长度及重量则均无显著差异（P>0.05）。综上所述，表达猪乳铁蛋白肽的重组屎肠球菌能够起到促进断奶仔猪生长及抗ETEC感染的保护作用。     

原料奶中金黄色葡萄球菌分离鉴定及产毒菌株的快速检测

为了蟹原料奶中产毒型金黄色葡萄球菌的污染情况,采用传统分类学鉴定方法与PCR鉴定方法结令,对原料奶中金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,并运用全自动荧光免疫分析仪检测了分离.菌株的产毒情况.结果表明,分离鉴定的70株金黄色葡萄球菌中,mini-VIDAS仪分析为阳性的有9株,产毒型金黄色葡萄球菌的检出率为12.86%,金黄色葡...     

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin，LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT^-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列，并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段；将供体片段转化至ETEC K88，同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统，对LT基因进行敲除；通过PCR验证获得了K88 LT^-缺陷菌株，并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示，λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段，CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除，最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明，K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力丧失，并且生长速度比野生型菌株减缓，LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT^-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

丁酸梭菌对小鼠健康状况的影响

为研究丁酸梭菌对小鼠生长性能、血清细胞因子含量和肠道紧密连接蛋白表达量的影响，试验将32只KM小鼠随机分为4组，分别为对照组、丁酸梭菌组、产肠毒素大肠杆菌K88组以及丁酸梭菌+产肠毒素大肠杆菌K88组。试验周期为14 d，期间测定小鼠生长性能。采用ELISA测定小鼠血清中二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）以及白介素-8（IL-8）的含量|采用Western blot检测回肠中紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达量。结果表明：在第7、14天时称重，与对照组相比，丁酸梭菌组的小鼠体重分别提高了5.79%、3.97%，但差异均不显著（P ＞ 0.05）|与产肠毒素大肠杆菌K88组相比，丁酸梭菌组DAO、TNF-α及IL-8含量显著降低（P ＜ 0.05），分别降低了13.81%、29.61%、37.29%|与对照组相比，丁酸梭菌组小鼠回肠紧密连接蛋白的表达量显著提高，分别提高了40%和20%（P ＜ 0.05）。综上所述，饲粮中添加丁酸梭菌能够调节小鼠炎症反应，改善小鼠肠道健康状况，且不影响小鼠生长性能。 [关键词] 小鼠|丁酸梭菌|产肠毒素大肠杆菌|生长性能|炎症因子     

Differential Expression Analysis of MUC4 and MUC13 Genes Between Resistant and Sensitive Weaned Meishan Piglets to ETEC F18

MUC4 and MUC13 genes as important candidate genes for enterotoxigenic Escherichia coil (ETEC) F4 resistance,may play an important role in the process of against ETEC F18 infection in weaned piglets. In this study,ETEC F18-resistant and -sensitive weaned Meishan piglets were used,and the expression levels of MUC4 and MUC13 genes in 11 tissues (heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,muscle,thymus,lymph nodes,duodenum and jejunum) were determined by quantitative Real-time PCR. The results showed that MUC4 and MUC13 genes were broadly expressed with different expression levels in all the 11 tissues. In the thymus and lymph tissues,the expression of MUC4 gene in resistant piglets was significantly higher than that in sensitive piglets (P<0.05);In the lung tissue,theMUC13 gene expression level in resistant individuals was significantly higher than that in sensitive individuals (P<0.05),and in the intestinal tissues of duodenum and jejunum, the expression level of MUC13 gene was relatively higher in resistant individuals. Thus we speculated that the high expression of MUC4 gene in immune tissues and MUC13 gene in intestinal tissues might improve the immune ability of piglets,protect and lubricate the intestinal tract, and resist ETEC F18 infection.     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

奶牛猝死病例中O101大肠杆菌的分离及部分毒力相关抗原的鉴定

为鉴定引起奶牛猝死综合征的病原及其毒力相关抗原,本研究无菌采集急性死亡奶牛的肝、脾、肾及小肠内容物样本,进行病原菌的分离和纯化,通过微生物学诊断、肠毒素试验、血清学试验、药敏试验和菌毛PCR进行鉴定,结果表明所分离的菌株为产ST肠毒素并具有F41菌毛、血清型为O101的大肠杆菌,该菌株对克林霉素、多黏菌素B、头孢曲松高度敏感。本实验为进行奶牛大肠杆菌性猝死综合征的防治奠定了基础。     

2个猪品种的ATP2B1基因表达与ETEC F4粘附性关联分析

以ATP2B1基因作为仔猪腹泻相关的候选基因,在2个品种63头猪的小肠组织中,采用实时荧光定量PCR技术对肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体不同黏附表型个体进行表达量的比较分析,以验证其基因功能和作为仔猪腹泻相关候选基因的可能性.结果表明:ATP2B1基因在不同黏附表型间的表达量有显著的差异,可望作为F4ab受体的相关...