甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。     

黑龙江省水稻穗腐病致病菌(Alternaria spp.)的鉴定及生物学特性分析

黑龙江省是我国水稻主产区，近年水稻穗腐病(rice spikelet rot disease,简称RSRD)对黑龙江省水稻产区的产量与质量造成的危害越来越严重。本研究旨在对黑龙江省水稻穗腐病致病菌链格孢属(Alternaria spp.)菌株的种类及生物学特性进行分析，为水稻穗腐病的防控提供参考依据。从黑龙江省病害发生区采集病穗样本，分离获得病原菌纯培养，利用分生孢子及菌落形态做形态鉴定，结合内转录间隔区(internal transcribed spacers,简称ITS)进行分子鉴定，菌丝生长速率法明确其生物学特性再采用水解圈法测定3种外分泌酶的产生情况。研究结果表明，黑龙江省水稻穗腐病的主要致病菌为Alternaria spp.,占总病原数量的83.43%;根据菌落及分生孢子形态把Alternaria spp.分成8种类型，ITS分子鉴定结果可将Alternaria spp.分为3类，分别为细交链格孢菌(Alternaria tenuissima,Ⅰ类菌),占Alternaria spp.总数的48.65%;链格孢菌(Alternaria alternata,Ⅱ类菌),占48.6...     

球孢白僵菌-玉米共生体对亚洲玉米螟取食行为的影响

为明确球孢白僵菌-玉米共生体对亚洲玉米螟幼虫取食行为及取食选择性的影响，本文通过室内控制试验，采用培养皿叶盘法，研究了共生体对亚洲玉米螟初孵幼虫和3龄幼虫的选择、非选择性取食的影响。结果表明，在48 h非选择性试验中，亚洲玉米螟初孵幼虫在球孢白僵菌-玉米共生体叶片组织（处理组）上的取食率显著低于未接种球孢白僵菌玉米叶片（对照组），第48 h时在共生体和对照玉米上的幼虫取食率分别为35.7%和62.5%，差异极显著；3龄幼虫在共生体茎秆组织上的取食率与对照组玉米差异不显著。在48 h选择性试验中，初孵幼虫在共生体玉米叶片组织上的取食率显著低于对照组，共生体玉米叶片组织上的幼虫取食率随时间的增加呈下降趋势，第48 h时在共生体和对照玉米上的幼虫取食率分别为6.3%和20.6%，差异极显著；3龄幼虫在共生体和对照组玉米茎秆组织上的幼虫取食率随时间的增加呈上升趋势，其中对照组幼虫取食率显著高于处理组，第48 h时在处理组和对照组玉米上的幼虫取食率分别为33.1%和45.6%，差异极显著。本研究初步表明，球孢白僵菌-玉米共生体对亚洲玉米螟幼虫的取食行为有显著的抑制和忌避作用。     

我国巴西橡胶树炭疽病的研究进展

炭疽病是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的重要叶部病害之一，严重影响橡胶产量。笔者对我国巴西橡胶树炭疽病的危害概况、症状、病原种类、病原生物学特性、病原分子致病机理和防控措施等研究现状进行综述，旨在了解我国巴西橡胶树炭疽病发展趋势、明确橡胶树田间病原菌种类及优势种，掌握炭疽菌生物学特性和分子机理研究现状，为巴西橡胶树炭疽病的进一步研究提供参考。     

单端孢霉烯族毒素生物脱毒技术研究进展

单端孢霉烯族毒素在粮食和饲料中污染严重,主要是T-2毒素和脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)等,其毒性作用强,对人和动物产生严重危害。因此,单端孢霉烯族毒素的脱毒方式逐渐成为研究热点,尤其是生物脱毒。很多微生物被证实能够降解霉菌毒素,包括细菌、真菌和酵母菌,可将毒素降解成低毒或无毒的产物。论文以生物脱毒为出发点,从细菌、真菌和酵母菌三个角度概述了单端孢霉烯族毒素中T-2毒素和DON的脱毒研究现状,以期为后续开发并挖掘更加安全高效的生物脱毒方式提供参考。     

水稻恶苗病防治药剂效果评价

为探明水稻恶苗病药剂防治现状,采用菌丝生长速率法分别检测了12种原药及12种制剂对多菌灵和咪鲜胺双重抗性藤仓镰孢菌(Fusarium fujikuroi)的室内毒力,并分别于2016和2017年进行了12种制剂的田间药效试验。室内毒力检测结果表明:12种原药抑菌活性强弱依次为戊唑醇氰烯菌酯咪鲜胺咯菌腈多菌灵甲基硫菌灵乙蒜素嘧菌酯噁霉灵福美双精甲霜灵甲霜灵;12种制剂抑菌活性强弱依次为0.25%戊唑醇FS25%氰烯菌酯SC25%咪鲜胺EC20%氰烯菌酯·杀螟丹WP25 g/L咯菌腈FS16%咪鲜胺·杀螟丹WP62.5 g/L精甲霜灵·咯菌腈FS22%氟唑菌苯胺FS12%甲·嘧·甲霜灵FS17%多菌灵·福美双FS17%杀螟丹·乙蒜素WP15%噁霉灵WP。2年田间试验结果表明:12种制剂推荐剂量下对水稻恶苗病防效高低依次为22%氟唑菌苯胺FS25%氰烯菌酯SC20%氰烯菌酯·杀螟丹WP17%杀螟丹·乙蒜素WP62.5 g/L精甲霜灵·咯菌腈FS12%甲·嘧·甲霜灵FS0.25%戊唑醇FS25%咪鲜胺EC16%咪鲜胺·杀螟丹WP25 g/L咯菌腈FS17%多菌灵·福美双FS15%恶霉灵WP。22%氟唑菌苯胺FS、25%氰烯菌酯SC、20%氰烯菌酯·杀螟丹WP等3种制剂在水稻恶苗病防治及抗性治理中具备更为优良的应用前景。本研究为水稻恶苗病防治提供了科学依据。     

吡唑醚菌酯/二氧化硅微球的释放行为与生物活性评价

为了对二氧化硅载药体系进行评价，以吡唑醚菌酯为模式农药，利用其与正硅酸乙酯在碱性条件下的水解缩合反应，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂，制备了吡唑醚菌酯/二氧化硅微球。通过扫描电子显微镜、Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱及高效液相色谱等表征了微球的表面形态和化学结构，测定了其在水中的光解速率；并采用透析袋法探讨了该微球在不同pH值和不同温度下的缓释行为，通过菌丝生长速率法测定了该微球对稻瘟病菌的毒力，评价了其生物活性。结果表明:所制备的吡唑醚菌酯/二氧化硅微球外观形貌较为规整，粒径在0.998~1.428 μm之间，其最大载药量可达50.73%。该微球在碱性条件下的释药速率快于酸性条件下，且其释放均符合一级反应动力学方程，在中性条件下其释药符合Ritger-Peppas方程；与pH值相比，温度对其释药速率的影响较小。给药后第5天，所制备吡唑醚菌酯/二氧化硅微球的毒力与原药相近，给药后第9天，其毒力是原药的11.7倍，缓释效果显著。该吡唑醚菌酯/二氧化硅微球在紫外灯照射10 h后光解率为38.98%，明显低于吡唑醚菌酯原药的光解率(68.92%)。     

一株侧孢芽孢杆菌发酵条件和培养基的优化

为获得一株侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)(NBF-129)发酵工艺,以发酵液活芽孢数为指标,在单因素试验基础上,采用正交试验对其培养基及培养条件进行优化。培养基优化结果为玉米淀粉2.0%、蚕蛹粉2.5%、酵母浸出粉1.0%、玉米浆1.0%。最佳培养条件为初始pH 7.5,培养温度30℃,转速220 r/min。优化后的侧孢芽孢杆菌摇瓶发酵液芽孢数达到4.12×10~9 CFU/mL,较优化前的2.30×10~9 CFU/mL提高79.1%。利用优化后的培养基和培养条件进行了30 L罐发酵小试,发酵周期为35 h,发酵液芽孢数为3.96×10~9 CFU/mL,发酵液离心浓缩后菌浆冷冻干燥,得到原粉芽孢数为6.70×10~(10) CFU/g。     

适用于蛋白质组分析的粉红单端孢菌蛋白提取方法的建立

为了优化一种适用于粉红单端孢菌双向电泳的蛋白质提取方法,以期为蛋白质组学水平研究粉红单端孢菌的致病机制奠定基础。以分离纯化后的粉红单端孢菌为试验材料,分别采用超声-TCA-丙酮、超声-磷酸-TCA-丙酮、超声-SDS、超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提等5种方法提取菌体蛋白质,通过对比分析蛋白质含量以及纯度筛选出2种较好的提取方法。在筛选聚丙烯酰胺电泳凝胶浓度的基础上,再通过双向电泳对比分析,得出最佳的蛋白质提取方法。结果表明,12%的聚丙烯酰胺凝胶浓度获得的单向电泳图谱背景清晰且无严重的拖尾现象,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得蛋白样品的质量浓度和含量分别为6.650 mg/mL和2.993 mg/g,该法提取蛋白通过SDS-PAGE分析条带清晰,双向电泳分析可获得1 238个独立清晰的蛋白点。由此可知,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得的粉红单端孢菌体蛋白适合于双向电泳分析及蛋白质组学研究。