外源添加山梨醇和海藻糖对意大利蜜蜂抗寒性能的影响

本试验旨在通过测定意大利蜜蜂(简称意蜂)体内山梨醇、海藻糖等相关生化物质含量、抗氧化酶活性及抗寒基因表达的变化,探究外源添加山梨醇和海藻糖在蜜蜂抗寒过程中的作用机制。从意蜂姊妹蜂群中随机选取900只刚出房的蜜蜂,随机分成6组,每组3个重复,每个重复50只蜜蜂,分别饲喂蔗糖溶液(对照)、海藻糖溶液和山梨醇溶液。6组均于常温(30℃)下饲养12 d,其中3组在饲喂12 d后进行冷处理(4℃冷驯化2 h)。饲喂12 d后立即测定蜜蜂过冷却点、冰点,比较其抗寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、糖原、脂肪含量、山梨醇脱氢酶(SDH)、海藻糖酶(THL)活性以及海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、SDH mRNA相对表达量的差异;另取900只意蜂,按照以上分组饲养,用于测定血淋巴中小分子糖醇含量。结果表明:1)与对照组相比,山梨醇组和海藻糖组过冷却点分别降低0.65(P0.05)、0.41℃(P0.05)。2)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组蜂体游离水含量变化不显著(P0.05)。3)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,海藻糖组和山梨醇组蜂体内脂肪含量变化不显著(P0.05),而糖原含量显著提高(P0.05)。4)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组血淋巴中葡萄糖含量显著增加(P0.05);常温条件下,山梨醇组血淋巴中果糖含量显著提高(P0.05),而冷处理条件下,海藻糖组血淋巴中果糖含量显著降低(P0.05);常温条件下,山梨醇组血淋巴中山梨醇含量显著增加(P0.05),而冷处理条件下,结果差异不显著(P0.05)。5)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组蜂体SDH和THL活性均显著提高(P0.05)。6)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组SDH mRNA相对表达量显著上调(P0.05);常温条件下,海藻糖组TPS mRNA相对表达量显著下调(P0.05)。综上所述,在室内饲养的离群意蜂外源添加山梨醇、海藻糖显著降低了意蜂的过冷却点、冰点,进而提高了抗寒性。山梨醇和海藻糖通过调节意蜂血淋巴中小分子糖醇含量,以及与山梨醇、海藻糖代谢通路相关的基因表达量来提高蜜蜂的抗寒性。     

乳糖诱导海藻糖合成酶基因工程菌条件优化

研究乳糖代替异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导海藻糖合成酶(Tres)在基因工程菌p ET-30a(+)Tres/BL21中的表达,分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式,确定了乳糖诱导的最佳条件。经过试验验证,工程菌对数生长中期,OD600 nm约为0.8时,分批次添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖于25℃条件下,诱导5 h,乳糖诱导的蛋白表达量达到最高值。通过试验证明,乳糖可以作为一种很好的诱导剂代替IPTG诱导p ET-30a(+)Tres/BL21中重组产物海藻糖合成酶,为今后海藻糖合成酶生产开发利用提供试验基础。     

两个褐飞虱海藻糖转运蛋白基因的结构及调控海藻糖代谢功能

【目的】海藻糖是昆虫中的主要血糖物质,在昆虫的发育及生理活动中发挥重要功能。其中,海藻糖转运蛋白（Tret）在将海藻糖从其生成组织（例如脂肪体）运输到其消耗组织的过程中起着重要作用。本研究通过分析褐飞虱（Nilaparvata lugens）两条Tret1的序列结构,进一步抑制NlTret1的表达,探讨这两个NlTret1在褐飞虱体内的生物学功能。【方法】以褐飞虱两条Tret1序列为研究对象,利用生物信息学技术分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。采用RNAi（RNA interference）技术将合成的外源dsRNA（double-stranded RNA）注射到实验室饲养褐飞虱种群体内,抑制其体内NlTret1的表达,分别在注射48 h后取材,抽取总RNA并用反转录试剂盒合成第一链cDNA,采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）技术检测dsNlTret1的干扰效果以及RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路中相关基因的表达,最后测定葡萄糖、海藻糖和糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】生物信息学分析表明,NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的开放阅读框长度分别为1 920和1 578 bp,分别编码639和525个氨基酸,预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD,等电点分别为8.32和8.36;NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的二级结构主要包含螺旋和卷曲;保守结构域分析显示它们均属于MFS家族。进化分析结果显示,不同昆虫的Tret1蛋白具有较高的同源性,且褐飞虱与其他半翅目昆虫具有较近的亲缘关系;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后均能够显著沉默本基因的表达;褐飞虱体内糖原、葡萄糖在注射dsNlTret1-like X1和dsNlTret1-2 X1后,其含量均无显著变化,然而不同于注射dsNlTret1-2 X1组,在注射dsNlTret1-like X1后褐飞虱体内海藻糖含量极显著升高;干扰NlTret1-like X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2、TRE1-1、TRE1-2和TRE2的表达均极显著下调;而干扰NlTret1-2 X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2和TRE1-1的表达虽也极显著下降,但TRE1-2和TRE2极显著上调;在注射dsNlTret1-like X1后,试虫可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均极显著降低,而在注射dsNlTret1-2 X1后无显著变化。【结论】褐飞虱的两个Tret1在不同组织间发挥着不同的功能,其中NlTret1-like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。研究结果有助于探索Tret1在昆虫或无脊椎动物中调控海藻糖代谢平衡的调节机制,可为将来通过调控血糖平衡来控制褐飞虱等害虫提供理论依据。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

野油菜黄单胞菌中6-磷酸海藻糖合成酶注释基因的功能鉴定

6-磷酸海藻糖在微生物碳代谢调节及抗逆生理中起着极其重要的作用。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)8004菌株的基因组中,XC1076注释为6-磷酸海藻糖合成酶。利用突变和表型检测技术,对XC1076进行功能鉴定,结果显示,XC1076的Tn5gusA5插入突变体006B12,在含3%NaCl的NYGB培养基中生长明显缓慢,在含葡萄糖为惟一碳源的NCM培养基中几乎不能生长,反式互补能够基本恢复野生型表型,这说明XC1076与碳代谢调控和抗高渗有关。这些表型实验结果揭示,XC1076的ORF编码的蛋白具有6-磷酸海藻糖合成酶活性。致病生化因子检测显示,XC1076与Xcc胞外酶和胞外多糖的分泌无关。     

外源海藻糖对NaHCO3胁迫下甘草幼苗生长调节及总黄酮含量的影响

本研究以甘草无菌苗为试验材料,采用植物组织培养的方法,分析50 mmol·L^-1 NaHCO₃ 胁迫下外源海藻糖对甘草幼苗生长量、叶绿素含量、渗透调节物质含量、抗氧化保护酶活性和总黄酮含量的影响。结果表明： 50 mmol·L^-1 NaHCO₃ 胁迫显著降低了甘草幼苗的生长量、叶绿体色素含量、K⁺ 浓度、抗氧化保护酶（SOD、POD、CAT）活性和总黄酮含量,显著提高了丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量以及Na⁺浓度;施加15 mmol·L^-1 海藻糖可显著提高甘草幼苗的生长量,提高叶绿素含量、K⁺ 浓度和总黄酮含量,降低丙二酸含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和Na⁺ 浓度,并且提高抗氧化保护酶活性。因此,NaHCO₃胁迫下施加外源海藻糖对甘草幼苗生长具有良好的调节作用,可以增强甘草的抗碱能力,促进甘草幼苗生长。本研究为外源海藻糖提高甘草耐碱性和揭示其调控机制提供理论依据。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

海藻糖对即食米粥回生抑制作用的研究

海藻糖在抗淀粉老化中的特殊作用在食品加工业里越来越占重要地位。本文对海藻糖对即食米粥的回生抑制作用进行了研究。分别添加碳酸氢钠、海藻糖和蔗糖后经测定数据表明,添加海藻糖后即食米粥能够有效抑制米粥的回生;不同海藻糖浓度对即食米粥的淀粉老化研究证明,当海藻糖的浓度为7%时,即食米粥的淀粉回生抑制率最高。     

海藻糖对日本对虾部分免疫指标的影响

以日本对虾(Penaeus japonicus)为实验对象,测定海藻糖对日本对虾部分免疫指标的影响.结果表明:注射海藻糖后,日本对虾血清的凝血活性增强,注射后96h,0.4%浓度组凝血活性达到最高,为对照组的2.5倍;注射后48h到96h,超氧化物歧化酶活性维持在一个较高的水平(p<0.05);酸性磷酸酶活性在注射48h时最高,明显高于对照组;溶血素活性在注射海藻糖后有明显增强,注射后48h,0.4%浓度组的活力达到最高,而0.2%浓度组分别在24h和96h时,溶血素活力达到峰值;注射海藻糖对血清抗菌活力基本没有影响,说明海藻糖对日本对虾的抗菌活力没有增强作用.     

酿酒酵母菌胞内海藻糖提取工艺参数的优化

建立了超声破碎酿酒酵母细胞和冷三氯乙酸化学浸提海藻糖的工艺，探索了离子色谱分析技术条件，采用响应曲面法（RSM），研究了液料比R、超声功率W、工作时间T1、超声总时间T2和浸提时间T3等5个试验关键因子对海藻糖提取的影响规律，并构建了动态控制的数学模型，得到了海藻糖提取最优工艺参数依次为：尺为7、W为698W、T1为4．9s、T2为7．3min、T3为9min。结果表明：模型极显著，具有可行性和有效性，超声功率、工作时间和超声总时间对海藻糖提取量的影响最大，为生产中的应用提供了科学依据。