黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

应用于花斑裸鲤增殖放流效果评价的两种标记方法对比研究

为探讨适应高原鱼类规模化增殖放流效果评价的标记方法,本研究选取黄河上游典型的规模化放流品种花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)为试验对象,对比可见植入荧光标记法和金属线码标记法标记花斑裸鲤的效果。结果显示:可见植入荧光标记的保持率是100%,死亡率3%,金属线码标记的保持率是85%,死亡率17%;单人标记速度可见植入荧光标记法大约是金属线码标记法的3倍;两种方法标记鱼类与未标记鱼类的体长体重均没有显著差异。3年的回捕监测显示,两种标记均可长期保留。鉴于可见植入荧光标记检测方法较金属线码标记保持率高,标记更为快捷,且检出率高,建议对高原鱼类的增殖放流效果评价采用可见植入荧光标记。     

布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因克隆测序及表达分析

为研究布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列和表达情况及其与生长发育的关系,本实验运用克隆测序方法检测CRTC1、CRTC3基因CDS区,并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术检测不同组织和不同月龄的mRNA相对表达量;并用免疫组化技术对蛋白进行定位分析。结果显示:克隆测序获得的布莱凯特黑牛CRTC1、CRTC3基因CDS区分别为1773 bp和1725 bp,分别编码590、575个氨基酸;运用生物信息学分析后发现CRTC1、CRTC3结构稳定性差,为亲水性、偏酸性蛋白;进化树显示与牛、瘤牛、山羊和绵羊的同源性高(>80%),蛋白互作网络图显示CRTC1、CRTC3蛋白与FoxO基因家族、AMPK家族等基因相互作用强。qRT-PCR结果显示CRTC1、CRTC3基因分别在睾丸和脂肪中mRNA相对表达量最高(P<0.01),在肌肉组织中亦有表达。在肌肉组织中,CRTC1、CRTC3基因mRNA相对表达量随着年龄的增加逐渐降低;免疫组化显示CRTC1、CRTC3蛋白主要在肌肉组织的肌原纤维中表达。以上结果表明,CRTC1、CRTC3基因调控肌纤维生长发育,进而参与肌肉生长发育相关调节。     

鹿茸及鹿血中布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可应用于快速检测鹿茸及鹿血中布鲁氏菌的方法,保证鹿产品的药用、食用安全,试验根据布鲁氏菌特异性基因IS711设计合成引物和探针,建立实时荧光定量PCR方法,对反应条件进行优化,并绘制标准动力学曲线,Y=-3.14X+37.62,R2=0.997.结果 表明:该方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,组内、组间重复性试验Ct值标准差小于0.5,变异系数均小于2％,最小检测拷贝数为2.65× 101 Copies/μL.该方法对目的 基因检测灵敏度高,可用于鹿茸及鹿血相关样本的检测,也可用于布鲁氏菌的定性和定量检测,为相关鹿产品的质量安全评估提供重要技术保障.     

施氮时期对葡萄叶片光合生理及内源激素水平的影响

以10 a生酿酒葡萄‘蛇龙珠’为试验材料，运用水肥一体化滴灌的方式分别在萌芽期（S1）、新梢旺长期（S2）、开花期（S3）、果实第一次膨大期（S4）和副梢生长旺期（S5）一次性施入300 kg·hm^-2尿素，对照为整个生育期均不施氮肥（CK），分别于花后50 d（DAF50）、花后85 d（DAF85）和花后120 d（DAF120）进行光合特性指标的测定，并采样分析氮肥施用时期对葡萄叶片光合生理及内源激素水平的影响。结果表明：各生育期施氮均能增加叶片净光合速率（Pn）及PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm），在花前施氮肥叶片Pn和Fv/Fm增加最为显著，最高分别达到18.22 μmol·m^-2·s^-1和0.854。S1、S2和S3处理显著增大了不同生育期叶片气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr），且S2处理在DAF85时最显著，Gs和Tr分别比CK高18.5%和10.8%；S3、S4和S5处理显著降低了叶片的胞间CO₂浓度（Ci）和非光化学淬灭系数（NPQ），S1处理叶片Ci与CK之间无显著差异。果实第一次膨大期之前施入氮肥能够显著增大各生育期叶片的PSⅡ电子传递量子效率（ФPSⅡ）和光化学淬灭系数（qP），最高分别达到0.889和0.959。可见，不同时期施氮肥，通过改变光合荧光相关参数影响叶片光能的吸收、传递、耗散和分配，从而改善叶片光能利用效率。氮肥的施用时期影响各生育期叶片内源激素的含量，施氮肥均显著提高了DAF85后叶片玉米素（ZT）含量，与CK相比至少提高21.9%；花后施入氮肥叶片中IAA含量在果实采收时保持在34.9 μg·g^-1以上，S4和S2处理GA₃含量最高，分别为7.11 μg·g^-1和6.49 μg·g^-1。因此，氮肥施用时期影响葡萄各生育期不同内源激素的积累。     

大豆种荚应答镰刀菌侵染的叶绿素荧光成像规律

  目的  种荚是大豆Glycine max防御霉菌侵染的第1道防线，部分大豆品种种荚具有极佳的田间霉变抗性，本研究目的在于寻找与豆荚霉变抗性相关的快速鉴定指标。  方法  采用叶绿素荧光成像技术，以高抗大豆‘QWT15-2’、中抗大豆‘E1’和易感大豆‘E314’为研究对象，对离体种荚接种轮枝镰刀菌Fusarium verticillioides，监测其叶绿素荧光参数变化情况。  结果  大豆种荚接种霉菌24 h后，通过叶绿素荧光成像系统可清晰观察到豆荚表皮病斑，叶绿素荧光参数发生显著变化。霉菌侵染后0~5 d，大豆种荚初始荧光参数初始荧光(F_o)、最大荧光(F_m)、可变荧光(F_v)大幅降低，非光化学猝灭系数q_N上升、Q_NP下降，最大光化学量子产量(F_v/F_m)、实际光化学效率(Φ_PSⅡ)及电子传递速率(R_ET)均呈下降趋势。  结论  高抗大豆‘QWT15-2’维持了较健康的组织形态，各荧光参数表现稳定；中抗大豆‘E1’和感病大豆‘E314’受霉菌侵染影响，其表皮组织破坏严重、荧光参数变化幅度大；其中F_v/F_m、F_m、F_v、q_N和Q_NP荧光参数对霉菌侵染响应敏感，可作为评价大豆种荚田间霉变抗性的鉴定指标。图4参17     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

免疫层析技术及应用的研究进展

免疫层析技术是一类以纳米级标记物探针作为示踪和标记物的检测技术。此类技术除了具有操作简易、反应迅速和时耗较短等特点外,还兼具低成本和高特异性,尤其适用于临场检测。免疫层析技术的发展随着时代需求也在不断加速和更新,现以经典的胶体金免疫层析技术为基础,综述时间分辨与镧系元素荧光免疫层析、荧光微球免疫层析、量子点免疫层析、纳米模拟酶免疫层析及结合新技术的免疫层析的原理、研究进展和临床应用,并对免疫层析技术的未来发展做出展望。     

山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响

为探究不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响,研究了不同保存温度和反复冻融次数对不同浓度梯度组鸭疫里默氏杆菌DNA样品浓度及荧光定量Ct值的影响.根据OmpA基因保守序列设计了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR特异性引物,产物大小为112 bp,退火温度为56℃.荧光定量循环阈值Ct值随DNA浓度的下降而升高.常温保存的DNA样品7 d后出现明显降解,保存温度为4、-20、-80℃时则对荧光定量PCR检测效率影响不大.较高浓度的A、B组DNA样品Ct值未受冻融次数的影响,而浓度较低的C、D组则在冻融21次后Ct值明显升高.研究建立了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR鉴定方法,Ct值随DNA浓度的下降而升高,DNA样品应低于4℃保存,低浓度DNA应避免反复冻融.