山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

固醇类物质对鹅颗粒细胞胆固醇转运相关基因表达的影响

【目的】揭示胆固醇转运相关基因在鹅不同发育阶段卵泡中的表达模式及固醇类物质对颗粒细胞上述基因表达的影响。【方法】首先应用RT-qPCR技术检测SREBP-2、STADR4、STAR和CYP11A1在产蛋高峰期鹅卵巢内不同发育阶段卵泡中的mRNA表达水平;然后分离鹅F1卵泡颗粒细胞体外培养,24 h后分别添加不同浓度胆固醇、25-羟胆固醇和洛伐他汀(胆固醇合成限速酶抑制剂)处理,最后使用MTT法检测细胞活性和RT-qPCR技术检测上述基因表达量。【结果】四个基因在不同发育阶段卵泡中的表达模式相似;高浓度胆固醇显著增加细胞活性(P0.05),25-羟胆固醇和洛伐他汀则降低细胞活性。随着胆固醇浓度升高,四个基因表达量均先升高后下降;25-羟胆固醇显著抑制SREBP-2和STAR的表达(P0.05);升高洛伐他汀浓度使SREBP-2表达量先降低后升高,与其余三个基因相反。【结论】胆固醇转运和类固醇激素合成相关基因表达量受固醇种类和浓度调节,并且与卵泡类固醇激素合成密切相关,这为揭示鹅卵泡发育机制和提高产蛋量提供了理论参考。     

生殖激素产品的应用和发展趋势

生殖激素是调控动物体内复杂生殖过程并影响繁殖性能的一系列的重要激素。近年来，利用生殖激素的批次化生产繁殖技术被广泛使用，提高了母猪的繁殖效率，促进了养猪业向集约化和规模化方向的发展。目前在批次化生产过程中主要采用孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）以及化学类激素进行繁殖调控。但是这些产品的应用仍存在一些问题，因此需要开发出成本低、活性好的高品质蛋白类生殖激素产品，应用于猪场批次化生产中，提高生猪养殖效率和降低生产成本，为提升我国乃至全球畜牧业的动物繁殖效率做出贡献，为动物和人类的健康提供重要保证。     

siRNA干扰牦牛Bmal1基因对颗粒细胞激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低Bmal1基因对体外培养牦牛颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌的影响。应用siRNA技术下调颗粒细胞中Bmal1基因的表达,利用ELISA试剂盒检测细胞培养液中E2与P4含量,再通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)检测细胞激素分泌相关基因的表达情况。结果显示:经si-Bmal1转染颗粒细胞后,E2分泌量显著下降,P4分泌量极显著下降;在mRNA检测水平上,激素合成相关基因Cyp19a1、Star的表达量下降;在蛋白检测水平上,Cyp19a1、Star的结果与mRNA表达基本一致。综上表明,敲低Bmal1基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养牦牛颗粒细胞E2和P4的分泌水平,Bmal1基因参与牦牛颗粒细胞激素分泌的调控。     

石英毓麟汤佐治多囊卵巢综合征54例

目的:观察石英毓麟汤治疗多囊卵巢综合征的临床疗效。方法:选取2014年7月至2017年5月在医院接受治疗的多囊卵巢综合征患者108例,将其随机分为两组。对照组54例给予戊酸雌二醇及氯底酚胺治疗,观察组54例加用石英毓麟汤治疗。比较两组治疗效果、内分泌激素水平、血清瘦素水平及不良反应。结果:观察组治疗总有效率94.44%,高于对照组(79.63%),且内分泌激素及血清瘦素水平比对照组低,差异有统计学意义(P0.05);两组均未见严重不良发应。结论:多囊卵巢综合征患者给予石英毓麟汤治疗可有效改善血清瘦素及内分泌激素水平,疗效显著,且用药安全可靠。     

卵巢线虫(Contortylenchus genitalicola)在中国松褐天牛上的分布与作用研究

[目的]日本学者Kosaka与Ogura发现松褐天牛成虫除携带松材线虫外,雌成虫卵巢内还携带有另一种线虫,他们将其命名为卵巢线虫,并认为这种线虫是松褐天牛成虫的寄生性线虫。我国对该种线虫的研究迄今未见报道。为了证明这种线虫在我国是否存在和分布,开展了本项研究。[方法]分期分批捕获刚羽化的松褐天牛雌雄成虫,采用解剖松褐天牛成虫松树木质部及感病的松褐天牛幼虫等方法,调查卵巢线虫的存在与分布。[结果]通过调查研究,发现我国的松褐天牛成虫体内有该卵巢线虫存在,分布于松褐天牛成虫、幼虫体内和松树木质部3个部位;在松褐天牛成虫体内的卵巢线虫通过松褐天牛雌成虫产卵而接种、进入寄主树木木质部中。同时,木质部的卵巢线虫也有一部分进入松褐天牛幼虫体内寄生,另一部分仍在木质部生活,当松褐天牛幼虫再次发育为成虫时,在木质部中的卵巢线虫和已被寄生的松褐天牛幼虫体内的卵巢线虫再次进入松褐天牛成虫体内,完成循环。卵巢线虫在松褐天牛雌、雄虫体内均有分布,携带率为44.4%,其中松褐天牛雌成虫携带率为43.8%,松褐天牛雄成虫携带率为45.0%,两者间无显著差异;每头松褐天牛成虫平均携带卵巢线虫574条,其中雌成虫平均携带816条,雄成虫平均携带308条,具显著差异。初步研究表明,卵巢线虫在松褐天牛成虫体内只能完成产卵到1~4龄的幼虫阶段,不能完成一个完整的世代;在松褐天牛幼虫体内寄生和在木质部生活的卵巢线虫能完成一个完整世代,但具体过程尚不清楚;调查中未观察到卵巢线虫对松褐天牛成虫有寄生致病或致死的现象,但对松褐天牛幼虫有寄生致死的能力;卵巢线虫常与松材线虫同时存在,而且侵入松树及离开松树的方式与松材线虫相同。[结论]我国松褐天牛体内也发现有卵巢线虫存在;目前尚不能证明该线虫对松褐天牛成虫具有寄生致死性,但对松褐天牛幼虫具有一定的寄生致死性;卵巢线虫的生活史与松材线虫相似,是否与松材线虫一样对松树具有危害性以及其病理作用还有待于进一步研究。     

丹栀逍遥散对多囊卵巢大鼠高雄激素血症雄激素、瘦素及其受体表达的影响

目的 观察丹栀逍遥散对多囊卵巢综合征伴高雄激素血症大鼠雄激素、瘦素及其受体的影响。方法 利用脱氢表雄酮诱导建立多囊卵巢大鼠高雄激素血症模型，随机设立丹栀逍遥组、达英组、模型组、空白对照组，予以相应药物干预。实验结束后观察卵巢形态学变化；酶联免疫法测定血清雄激素水平；ELISA法检测血清瘦素；免疫组化测定卵巢瘦素受体的表达。结果 与模型组相比，丹栀逍遥散可显著降低大鼠血清瘦素、睾酮、游离睾酮水平值，减少卵巢瘦素受体阳性表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 丹栀逍遥散可降低多囊卵巢高雄激素血症大鼠血清瘦素、雄激素水平值，减少卵巢瘦素受体阳性表达，进而降低瘦素生物利用度及雄激素活性，从而改善多囊卵巢综合征高雄激素血症和排卵障碍。     

护卵汤对慢性应激超排卵小鼠卵巢TGF-β1,P-Smad3及FSHR mRNA表达的影响

目的 观察护卵汤对慢性应激超排卵小鼠卵巢转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）、信号蛋白P-Smad3及卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）mRNA表达的影响。方法 建立慢性应激小鼠模型，造模成功后，随机分为模型组、护卵汤组和生长激素组，另设正常组。在超排卵第3天和注射绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）24 h后，检测各组卵巢TGF-β1、P-Smad3及FSHR mRNA表达。结果 与模型组比较，在超排卵第3天，护卵汤组和生长激素组TGF-β1、P-Smad3及FSHR mRNA表达均显著升高（P<0.01或P<0.05）；注射HCG 24 h后生长激素组表达升高更明显（P<0.01）。结论 护卵汤可能通过激活TGF-β/Smads信号通路，发挥促进卵泡发育和改善卵巢功能的作用。     

高效氯氰菊酯对小鼠卵巢生殖功能的影响及维生素E的干预作用

为探究高效氯氰菊酯 (beta-cypermethrin, β-CP) 对雌性小鼠卵巢生殖功能的影响及维生素E (vitamin E, VE) 的干预作用，将雌性昆白小鼠随机分为6 组:空白对照组 (花生油处理)、β-CP不同剂量 (10、20、40 mg/kg) 处理组、VE保护组 (20 mg/kg β-CP+20 mg/kg VE) 和VE组 (20 mg/kg VE)，连续灌胃10 d。灌胃结束后取小鼠卵巢组织，观察组织结构的病理变化，采用免疫组化法、蛋白免疫印迹试验及RT-PCR方法检测卵巢中StAR蛋白含量及casp-3、casp-8、INHα和INHβB 基因mRNA表达的变化。结果显示:与对照相比，10、20和40 mg/kg的β-CP处理均使小鼠卵巢组织结构发生了损伤，使组织中StAR蛋白的浓度分别降低了18.8%、36.3%和40.3%，casp-3基因的表达分别升高了16.0%、26.7%和52.9%，INHα基因的表达分别升高了34.5%、83.6%和228.7%，INHβB基因的表达分别升高了7.5%、39.2%和52.7%；20和40 mg/kg的β-CP处理使得casp-8基因的表达分别升高了27.1%和36.7%。上述处理组与对照组的差异均达显著水平 (P＜0.05)。与 20 mg/kg β-CP处理组相比，VE 保护组的StAR蛋白含量也显著增多 (P＜0.05)。研究表明，β-CP对小鼠卵巢具有毒性作用，这与β-CP抑制StAR蛋白的合成，上调casp-3、casp-8、INHα及INHβB基因的表达有关；添加VE对小鼠卵巢有一定的保护作用，这与VE可减弱β-CP对StAR蛋白合成的抑制作用有关。     

卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关性

细胞自噬是哺乳动物细胞物质代谢的一个重要机制，与细胞凋亡共同参与卵巢卵泡的发育和闭锁，并发挥重要的作用。近年研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路参与卵巢疾病的发生。PI3K和AKT的过度激活可使原始卵泡过早发育以及卵泡过快凋亡，卵巢颗粒细胞作为卵泡发育重要的支持细胞，其功能的减退或凋亡很可能引发一系列女性内分泌方面的疾病。FOXO3a转录因子是PI3K/AKT信号通路下游的重要靶蛋白之一，参与抗增殖和凋亡。本文就关于卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关进展加以综述。