华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究

本文首镒报道了华癸根瘤菌在水稻，小麦，油菜和棉花４种非豆科作物根圈定的定殖能力。分别通过盆栽试验并采用外源标记基因特异性检测技术进行检测，研究发现华癸根瘤菌不但可以在这４种非豆科植物根圈定殖，而且还能进入根内，其数量可达１０＾３个／ｇ以上。接种华癸根瘤菌对油菜和棉花根系的生长有一定影响，并能显著促进水稻的生长，为扩大华癸根瘤菌的应用范围展示了诱人的前景。  

华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)研究进展

综述了华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)遗传多样性、质粒多样性、质粒的功能、结瘤因子、结瘤基因、胞外多糖等方面的研究进展。这类菌只能在紫云英上结瘤,1997年并入Mesorhizobium。选取大量菌株进行REP-PCR、16S和23S rDNAPCR-RFLP等分析,揭示其分为16种16S rDNA基因型。选用不同16S rDNA基因型的部分代表菌株进行部分16S rDNA测序。能够在紫云英上结瘤的根瘤菌可以分为2个类群。表明这类菌具有遗传多样性,存在不同的种。它们多数含共生质粒,共生质粒定位于最大或次大质粒上,质粒数1~5个不等,其分子量范围在53~906 kb之间。质粒缺失菌株表现为不结瘤(Nod-)和结瘤而不固氮(Nod ,Nif-)。某些质粒缺失还影响LPS合成、抗酸性、竞争结瘤能力。其结瘤因子能诱导紫云英根毛变形,它们的结瘤因子结构类似于苜蓿根瘤菌的结瘤因子。它们的结瘤基因具独特性,nodA与nodBC分隔一定距离,且具有保守性。它们产生的胞外多糖在侵染结瘤过程中发挥重要作用。  

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii 7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56.使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii 7653R中克隆了exo56序列.exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需.盆栽结果表明,ezc56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤.  

华癸中生根瘤菌的分离、回接及质粒检测

从华中农业大学的水稻田中采集的紫云英根瘤中分离到62株华癸中生根瘤菌,对其中的57株进行了回接结瘤试验,供试菌株均能正常结瘤.并对其中的44株进行质粒检测,13株含3个质粒,21株含2个质粒,7株含1个质粒,3株不合质粒,质粒分子量范围约为174～510kb,为研究华癸中生根瘤菌内源性质粒的相互作用及其共生固氮效应奠定了良好的基础.  

用Tn5标记带发光酶基因的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakui)7653R质粒

在ｐＲＫ２０７３的辅助作用下，通过三亲本接合转移，将Ｔｎ５（ｓａｃＢ－ｌｕｘＡＢ）插入华癸根瘤菌７６５３Ｒ菌株基因组中。将３２００个Ｔｎ５标记菌株影印到含有８％蔗糖的ＹＭＡ平板，检测这些菌株的发光酶活性和新霉素抗性。共获得８个菌株，其选择标记消失。质粒检测发现其共生质粒有不同程度的缺失甚至消除。结瘤实验证明，所有共生质粒部分缺失（有的缺失达１／３）的菌株依然结瘤。经用ｌｕｘＡＢ探针的分子杂交证实，８个菌株中有３个对应的标记菌株其Ｔｎ５插在共生质粒上。  

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株.PCR及测序验证双交换突变株构建成功.植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异.  

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R sRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraG sRNA.本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测.盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40％,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低.结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程.