棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析，探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能，为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫2067为试验材料，根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（dehydrin，Dhn）基因的CDS序列，利用Primer5软件设计引物，克隆该基因，并命名为GhDHN1；采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树；选择XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点对植物表达载体pBI121::GFP进行双酶切，采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体pBI121-GhDHN1::GFP；分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达，进行亚细胞定位；利用抗冷材料豫2067在三叶期对低温处理（4℃，24 h）前后的叶片和根系进行转录组测序，筛选差异表达基因；在三叶期时分别对豫2067（抗冷品种）和衡棉3号（冷敏感品种）进行低温（4℃，24 h）处理，利用实时荧光定量方法分别比较根、茎、叶中GhDHN1表达量，对该基因在2个抗冷差异材料叶中的表达量进行比较；对豫2067进行不同时间低温（4℃）处理，分析GhDHN1在叶片和根中的动态表达模式。【结果】该基因全长为726 bp，开放阅读编码框为636 bp，编码211个氨基酸，预测分子量为23.79 kD，等电点为5.04，富含谷氨酸（26.10%）和赖氨酸（19.40%），不含色氨酸，半衰期为30 h，蛋白呈酸性，带负带荷，带负电荷的残基总数为60%；GhDHN1的二级结构α螺旋（Alpha helix）包含116个氨基酸残基，占54.98%，组成该蛋白的主体结构，无规则卷曲（Random coil）的氨基酸残基有87个；GhDHN1位于陆地棉D亚组第9染色体（Dt_chr9）上，在cDNA的259—348位置上含有一个长度为90 bp的内含子，2个外显子长度分别为258和378 bp；SMART和CDD分析表明该氨基酸序列含有2个保守的富含赖氨酸的K片段和1个保守的富含丝氨酸S片段，具有亲水素蛋白结构域pfam00257，表明该蛋白为K2S型脱水素；系统进化树分析表明，陆地棉亲水素GhDHN1与可可亲缘关系最近；洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明，GhDHN1蛋白主要定位在细胞膜附近。转录组分析表明，该基因在棉花三叶期叶片和根中，受低温处理后上调表达；荧光定量PCR分析表明，GhDHN1在4℃低温胁迫24 h后，在叶片、茎、根中均上调表达，在叶中上调表达倍数最大，在低温处理4 h和24 h时叶片中有2个表达高峰，在低温处理6 h和12 h时在根中有2个表达高峰，在抗冷材料叶片中的表达是冷敏感材料的2.47倍，说明该基因可能参与了棉花对低温的适应性调控。【结论】陆地棉GhDHN1属于典型的K2S型脱水素，与可可亲缘关系最近。该基因响应低温胁迫，在抗冷材料和冷敏感材料中表达差异显著，其表达量与棉花的抗冷性呈正相关，可以作为筛选不同抗冷材料的标记，同时可以作为重要的候选基因来培育棉花抗冷新材料。  

组氨酸激酶基因envZ调控禽致病性大肠埃希菌生物被膜的机制研究

目的 研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)生物被膜形成能力的影响，了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制，为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。方法 采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株，比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。结果 成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ；envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响，但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比，envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达，与生物被膜形成相关的基因显著下调。结论 envZ基因除了响应环境渗透压，还参与调控APEC生物被膜的形成。  

比较转录组分析揭示花生种皮花青素积累的分子调控机制

花青素作为一种抗氧化物质,具有多种保健功效。与其他颜色花生相比,黑种皮花生具有良好的感官品质,且花青素含量更高。为了揭示花生黑种皮花青素形成和调控的分子机理,本研究以黑种皮花生(YH29)和粉红种皮花生(WH10)为研究对象,通过RNA-seq技术比较其转录组的差异。结果表明,与粉红种皮花生相比,黑种皮花生中1 539个基因表达上调,1 275个基因表达下调。KEGG分析发现花青素生物合成、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等多个与色素积累相关的通路在黑色种皮花生中富集。在黑种皮花生中,苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶等5个与花青素合成相关的关键酶基因表达上调,而与花青素生物合成途径竞争同一底物的一些关键酶基因,如柚皮素和甘草素基因,则表达下调,这使得有更多的底物流向花青素合成途径,这些基因的协同表达可能是黑种皮花青素高水平积累的关键。另外,两个R2R3-MYB转录因子在黑种皮花生中也表达上调,可能是引起花青素合成关键基因表达差异的关键因素。我们的研究结果为深入研究花生种皮花青素合成的分子机理及培育高花青素含量的花生新品种提供了参考。  

花椰菜温敏雄性不育系GS-19花药败育的细胞学及转录组分析

【目的】对花椰菜温敏雄性不育系的花器形态、花药败育时期和败育分子机理进行研究,明确其不育特性发生的细胞学和分子机理,为进一步研究其雄性不育奠定理论基础。【方法】以花椰菜温敏雄性不育系GS-19为试验材料,不同温度(15℃和20℃)处理,采用形态学、细胞学方法及高通量测序技术(Illumina Hi Seq 2500),研究其形态特征、花药败育的细胞学及分子机理。【结果】花椰菜温敏雄性不育系GS-19的育性转换受温度控制,高温(20℃)不育,低温(15℃)育性恢复。GS-19不育株与可育株花器差异显著,不育株花器显著小于可育株。花药细胞学观察发现GS-19的花药发育过程有花粉母细胞的分化,形成正常花粉囊,不产生花粉粒或者产生微量的无生活力的花粉粒,花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,形成了花粉粒外壁发育异常的拟"四分体孢子",逐渐降解,剩下花粉空壳,属于花粉母细胞败育类型。GS-19不育株和可育株花蕾转录组分析共获得67 930个Unigene,其中Nt数据库比对到相似序列数最多(52 191个),Nr数据库比对到相似序列次之(46 447个),KOG数据库比对相似序列最少(13 198个);GO注释到25 336个Unigene;KOG注释到13 198个Unigene;KEGG注释到14 778个Unigene。基因差异表达分析发现GS-19不育株花蕾和可育株花蕾中有2 170个基因差异表达,1 078个基因上调表达和1 092个基因下调表达。【结论】花椰菜温敏雄性不育系GS-19为高温不育类型,不育株花器显著小于可育株,花丝显著缩短,花药萎缩、干瘪,花药发育受阻于花粉母细胞到四分体时期,属于花粉母细胞败育类型。转录组测序获得了67 930个Unigene,差异表达基因2 170个。  

黄瓜不同性型花中差异表达的MADS-box基因

MADS-box基因家族是一类转录调控因子,影响植物各个生长发育的环节,尤其是花器官的发育。随着模式植物MADS-box基因研究的深入,一些该类基因的作用方式已经被阐明。黄瓜的性型直接关系到其产量,黄瓜中MADS-box基因对其性型的影响尚未清楚。本研究对6组不同黄瓜性型的近等基因系材料的花芽以及顶芽进行转录组分析,利用生物信息学方法,获得9个不同性型花芽和顶芽差异表达的MADS-box基因:Cucsa.018420、Cucsa.113420、Cucsa.251170和Cucsa.327970在雄花中特异表达,Cucsa.139620、Cucsa.160640、Cucsa.241990在雌花和两性花中的表达差异显著,Cucsa.212720和Cucsa.392160在雌花中特异表达。通过荧光定量RT-PCR验证了其中两个差异表达基因Cucsa.018420和Cucsa.392160的表达,发现两者在整个花发育过程中的表达规律与转录组结果一致。本研究初步探讨了MADS-box基因对黄瓜花性型的影响,为黄瓜MADS-box基因的深入研究提供参考。  

杨凌糖丝菌Hhs.015拮抗苹果树腐烂病菌转录组分析及抗菌机制探究

杨凌糖丝菌Hhs.015是一株稀有放线菌，能够广谱高效地拮抗病原真菌。为了研究其抗菌机理，对Hhs.015拮抗苹果树腐烂病菌Valsa mali的过程进行转录组分析。鉴定到533个差异表达基因，其中310个基因上调表达，223个基因下调表达。在此过程中，杨凌糖丝菌Hhs.015的信号传递、能量供应、细胞壁合成等功能受到Valsa mali的抑制。通过碳水化合物、氨基酸等物质的代谢增强补充能量的供应，ABC和MFS家族蛋白对于次级代谢物的运输和Valsa mali毒性物质的排出起到重要作用，糖苷水解酶的大量上调表达破坏了Valsa mali细胞壁合成，抑制了Valsa mali的生长。还预测到5个未知的次级代谢物在抗菌过程中起到重要作用，这些物质可以被运用于生态友好型的农业发展中，加快可持续发展的进程。  

马铃薯氮代谢对低氮胁迫的响应及转录组分析

【目的】探究不同氮效率马铃薯品种氮代谢对低氮胁迫的响应及分子机制，为马铃薯氮高效育种及高产栽培提供理论依据。【方法】以氮高效马铃薯品种冀张薯12号和氮低效马铃薯品种尤佳70为材料，采用盆栽试验方式，设置低氮（3 mmol/L纯氮）和正常施氮（15 mmol/L纯氮）处理，在出苗后30 d测定植株的干质量、氮积累量及氮代谢相关酶(硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）)活性，并依托Illumina HiSeq 2000平台进行转录组测序分析。利用DESeq进行差异基因分析，通过GO富集和KEGG Pathway数据库注释参与马铃薯氮胁迫响应的差异表达基因。【结果】2种施氮量下冀张薯12号茎叶和根系的干质量、氮积累量以及NR、NiR、GS、GOGAT活性均高于尤佳70。与正常施氮相比，低氮胁迫下2个马铃薯品种茎叶和根系的干质量、氮积累量及叶片的NR和NiR活性均显著降低，根系的GS活性显著提高；尤佳70叶片的GS活性、GOGAT活性和根系的GOGAT活性均显著降低，冀张薯12号根系的NiR活性显著降低。转录组分析结果表明，在2个施氮量对比组中，尤佳70叶片和根系中的差异表达基因分别有6 173个和249个，冀张薯12号叶片和根系中的差异表达基因分别有3 455个和1 990个。GO和KEGG结果显示，冀张薯12号的差异基因主要涉及氮代谢、氨基酸代谢等生物过程，尤佳70的差异基因主要涉及光合作用等生物过程。尤佳70和冀张薯12号根系中富集到氮代谢通路的差异基因分别有1个和8个，叶片中分别有11个和8个。尤佳70和冀张薯12号叶片的氨基酸相关代谢途径中涉及上调差异表达基因最多的均是苯丙氨酸代谢，其中编码苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-CoA连接酶的基因表达显著上调。【结论】在低氮条件下，氮高效品种冀张薯12号氮代谢相关酶活性较高，能减缓低氮胁迫对氮代谢的影响，进而保证较高的氮效率。  

紫花苜蓿不同发育时期次生壁合成调控的转录组分析

【目的】探讨紫花苜蓿次生壁合成的基因网络调控变化和表达模式,确定一些关键候选基因和转录因子,为紫花苜蓿次生壁加厚调控网络的分子机制研究奠定基础。【方法】对‘中苜1号’紫花苜蓿分枝期(S1)、现蕾期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)的茎进行近红外光谱法测定次生壁主要物质含量和Illumina Hi SeqTM2500高通量转录组测序。以紫花苜蓿的近缘物种蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)基因组作为参考基因组进行序列比对并组装构建转录本。利用FPKM法计算基因表达量,以Fold change(差异表达倍数)≥2或≤0.5(表达上调或下调)、FDR(false discover rate)≤0.05为筛选条件,在3个相邻时期转录组比较组合中(S2VS S1,S3 VS S2,S4 VS S3)筛选差异表达基因。通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库对紫花苜蓿不同发育时期差异表达基因的功能和参与的代谢途径进行注释。【结果】共获得41 734个基因在紫花苜蓿不同发育时期的转录表达情况,27个功能注释与紫花苜蓿纤维素、木质素合成密切相关的基因差异表达,其变化趋势与纤维素和木质素含量测定结果基本一致,即随着生长发育时期的变化,表达水平逐渐提高。研究表明,初花期是紫花苜蓿次生壁合成调控的转折期,纤维素和木质素含量与其合成基因表达量在初花期均显著提高。MTR_2g016630(Ces)和MTR_7g103590(Ces A1)等纤维素合成酶基因表达水平在初花期显著上升,木质素合成途径中,MTR_1g064090(PAL1)、MTR_1g111240(C4H)和MTR_2g104960(CCR)基因表达量在初花期或盛花期相比分枝期上调表达倍数达到10倍以上。本研究中27个与植物生长发育相关的转录因子在紫花苜蓿不同发育时期差异性表达,其中NAC家族和MYB家族转录因子有18个,也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等转录因子。【结论】获得‘中苜1号’紫花苜蓿在4个生长发育时期茎的基因表达谱数据,共获得54个差异表达基因,其中稳定上调基因24个,稳定下调基因30个。这些基因很有可能参与紫花苜蓿次生壁的合成调控。  

松树内生细菌GD2对松材线虫入侵寄主时转录组的影响

为了进一步阐明细菌在松材线虫病中的作用,采用松材线虫(CK)和松材线虫与马尾松内生细菌GD2的混合物(T)分别接种马尾松,对松材线虫进行转录组测序、 Gene Ontology(GO)及KEGG富集分析,并利用Real-time Quantitative PCR(RT-qPCR)验证目标基因表达情况。结果显示,与对照组(空白虫)CK相比,共筛选到143个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中有63个上调基因,80个下调基因。Gene Ontology分析显示,差异表达基因在免疫系统过程、细胞膜、代谢过程、转运活性等功能类富集。KEGG通路在ECM-receptor互作、肾素-血管紧张素、糖酵解、胰岛素信号等通路富集。这些GO功能与KEGG通路涉及机体的免疫调节。选取8个基因进行RT-qPCR验证,表达水平与测序结果一致,证明了测序结果的准确性。表明菌株GD2可以通过提高松材线虫的免疫调节能力来影响松材线虫病的发生。  

氮胁迫下小麦叶片转录组分析

氮素是小麦生长发育过程中重要的营养元素，利用转录组技术鉴定参与小麦低氮胁迫分子调控网络的基因，对揭示小麦耐低氮分子机理、开展耐低氮育种具有重要参考意义。采用Illumina HiseqTM 2500高通量测序技术，对小麦品种晋麦47正常生长和低氮胁迫下的叶片进行转录组测序，筛选差异表达基因并在GO、KEGG 数据库中进行比对注释，分析小麦低氮胁迫响应相关基因。结果显示，对照组与低氮组分别获得高质量序列52 383 726和52 192 061条，检测到差异表达基因1 267个，其中上调表达基因179个，下调表达基因1 088个。差异基因GO功能注释到3个大类的44个功能组。差异表达基因被注释到178个途径上，主要富集于氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂类代谢和信号传导等途径。转录因子分析发现，在低氮条件下变化明显的转录因子家族包括WRKY、MYB和NAC等。