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1.
百合叶片总RNA提取方法比较及优化   总被引:11,自引:1,他引:10  
为筛选出适合百合叶片RNA提取方法,以铁炮百合‘白天堂’组培苗叶片为材料,比较了改进的CTAB、SDS及传统的Trizol、CTAB、SDS方法提取RNA的效果。结果表明:不论传统及改进的SDS法和Trizol法均不能有效去除百合叶片组织中的多糖、蛋白等杂质,传统CTAB法提取RNA存在DNA污染。针对百合叶片组织富含多糖多酚的特点,改进了CTAB法,采用醋酸钠及无水乙醇去除多糖,酚/氯仿反复抽提去除蛋白,DNaseⅠ去除DNA,LiCl有效沉淀RNA。采用此方法提取的RNA条带清晰,经紫外光谱分析D260/D280比值为2.0,D260/D230为2.1,电泳28S、18S条带清晰,比值约为1.5。RT-PCR结果表明,改进的CTAB法提取的总RNA可直接用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验。  相似文献
2.
棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析   总被引:4,自引:0,他引:4       下载免费PDF全文
 【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs, GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank 登录号为FJ848869)分别具有1 101 bp、1 098 bp、1 071 bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2 mmol•L-1IPTG在37℃下诱导6 h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。  相似文献
3.
黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析   总被引:4,自引:1,他引:3  
根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712 bp,5′端非翻译区有133 bp,3′端非翻译区有306 bp,包含1个273 bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24 h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.  相似文献
4.
雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因.氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94% ,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A 结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因.对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异.  相似文献
5.
Harpinxoo多克隆抗体制备、鉴定与应用   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
 以纯化harpin蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗Harpin蛋白的多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1:2000,经亲和层析纯化,Western blot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpin蛋白可以特异性结合,表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpin编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此,兔抗harpin抗体的成功制备,为进一步深入研究harpin的生物学功能、细胞定位以及在其他植物中的表达等奠定基础。  相似文献
6.
枣树花分生组织特异基因ZjAP1的克隆与表达分析   总被引:2,自引:1,他引:1  
以枣树(Ziziphus jujuba Mill)为试材,通过反转录RT-PCR和快速扩增cDNA末端的方法,从花萼片组织中克隆获得一个花分生组织特异性基因的全长序列(SQUA/AP1同源基因),命名为ZjAP1(GenBank登录号:EU916199)。生物信息学分析ZjAP1cDNA序列的开放阅读框长度为738bp,编码245个氨基酸,保守域含有SQUA/AP1家族典型的MADS盒蛋白、K盒结构域。ZjAP1的氨基酸序列与其他植物SQUA/AP1具有很高的相似性,进化树分析表明,ZjAP1和其他物种的AP1起源于相同的祖先。半定量RT-PCR分析表明,ZjAP1在花芽、花蕾、花、幼果中都有表达,在结果枝中整个花发育过程中一直有表达,在营养枝和膨大的果实及种仁组织中没有表达,说明ZjAP1与花发育的调控有关。  相似文献
7.
普通小麦及其近缘种NCED基因的克隆及表达分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
利用已知的大麦NCED基因(dbj|BAF02837.1)保守区域设计引物,在野生一粒小麦、硬粒小麦、野生二粒小麦、普通小麦和粗山羊草中分别扩增出长度为782、782、782、783、783 bp的目的片断,生物信息学分析结果表明,均含有一个开放阅读框,编码242个氨基酸残基组成的蛋白,具有典型的9-顺式-新黄素加双氧酶蛋白的结构域.同源性比对结果表明,普通小麦与大麦的NCED序列具有高度同源性(97%);普通小麦及其近缘种在该区内NCED基因片段的同源性在95%以上.半定量RT-PCR表达分析表明,NCED基因参与了普通小麦及其近缘种对非生物胁迫高渗、高盐的应答反应,但在不同物种或胁迫处理下的表达模式不同,其中粗山羊草和普通小麦在高渗和高盐胁迫下分别表现出了较快的应答反应.  相似文献
8.
毛白杨亚油酸去饱和酶基因的克隆与表达模式分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
以毛白杨为材料,利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并获得了理论的杨树亚油酸去饱和酶cDNA序列全长,通过RT-PCR手段首次克隆得到了毛白杨PtFAD3基因编码序列cDNA (GenBank 登录号: DQ354393),该 cDNA 全长 1 199 bp,开放阅读框编码383个氨基酸.通过RT-PCR半定量研究表明PtFAD3在叶片中的表达量最高,茎和根中的表达量依次降低;用低温、干旱、NaCl、ABA分别处理毛白杨组培苗,叶片中的PtFAD3表达量在逆境初期 24 h 之内没发生变化.该研究为毛白杨脂肪酸去饱和酶的研究以及植物脂肪酸基因工程提供了基础.  相似文献
9.
蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因的克隆与表达分析   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
【目的】对蒺藜苜蓿ROP基因进行克隆与表达分析,为深入研究ROP基因在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】依据拟南芥11个ROP保守序列特征和蒺藜苜蓿数据库信息,同源克隆蒺藜苜蓿的MtROP9基因,采用生物信息学方法对该基因序列进行分析,并采用半定量RT-PCR法,对MtROP9基因在蒺藜苜蓿不同组织及根瘤菌侵染后不同时间根系中的表达水平进行检测。【结果】从蒺藜苜蓿根系中克隆到了MtROP9基因的cDNA序列,全长为947 bp,编码209个氨基酸。序列分析表明,MtROP9具有ROP蛋白典型的结构特征,并与拟南芥AtROP9、水稻OsRac2、葡萄VvROP9、玉米ZmROP6和ZmROP7具有高度的相似性。MtROP9基因具有一定的时空表达特性,在根系和花中表达水平较高,在茎和根瘤中表达水平相对较低,在叶中几乎不表达。在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作的早期,MtROP9基因能够被根瘤菌侵染诱导表达,在根瘤菌诱导处理不同时间的根系表达水平不同。【结论】克隆了蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因。MtROP9基因可能参与了豆科植物与根瘤菌共生互作早期信号的调控。  相似文献
10.
苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
【目的】克隆苹果(Malus×domestica B.)中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因(MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885),其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域(motif I-V),含有2个功能结构域:malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。  相似文献
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